DB37∕T 3801-2019 花生品种纯度鉴定技术规程—SSR标记法(山东省).pdf
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1、ICS 65.020.01 B 05 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 38012019 花生品种纯度鉴定技术规程SSR 标记法 Protocol of purity identification for peanut variety using SSR markers 2019 - 12 - 24 发布 2020 - 01 - 24 实施 山东省市场监督管理局 发 布 DB37/T 38012019 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 原理 . 2 5 仪器设备 . 2 6 试剂 . 2 7 溶液配制 . 2 8 引物
2、信息 . 2 9 操作步骤 . 2 9.1 样品准备 . 2 9.2 单粒种子的 DNA 提取 . 2 9.3 PCR 扩增 . 3 9.4 PCR 产物检测 . 3 10 判定方法与原则 . 4 10.1 判定方法 . 4 10.2 判定原则 . 4 附录 A(规范性附录) 溶液配制 . 5 附录 B(资料性附录) 推荐引物 . 7 附录 C(资料性附录) 参照品种名单 . 9 DB37/T 38012019 II 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。 本标准由山东省农业标准化委员会归口。 本标准起草单位:山东省花生研究所。
3、本标准主要起草人:单世华、闫彩霞、赵小波、李春娟、王娟、苑翠玲、孙全喜、宋秀霞。DB37/T 38012019 1 花生品种纯度鉴定技术规程-SSR 标记法 1 范围 本标准规定了利用简单重复序列 (Simple sequence repeat, SSR) 标记法进行花生 (Arachishypogaea L.)品种鉴定的原理、仪器设备及试剂、操作步骤、判定方法与原则。 本标准适用于试验样品为种子的花生品种的纯度鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件, 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文
4、件。 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 品种纯度 Variety purity 品种在SSR标记带型上典型一致的程度,反映鉴定品种的特征特性。 3.2 简单重复序列 Simple sequence repeat(SSR) 由几个核苷酸(16个)为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp(一般为100200)的串联重复序列,又称微卫星序列或短串联重复序列,其多态性主要来源于串联数目的不同。 3.3 推荐引物 Recommended primer 根据最少引物区分最多品种的原则,
5、筛选出多态性高,条带清晰、重复性好的一套SSR引物。 3.4 参照品种 Reference variety 具有推荐SSR位点上不同等位变异的花生品种,用于辅助确定送检样品的等位变异,校正仪器设备的系统误差。 DB37/T 38012019 2 4 原理 不同花生品种由于遗传组成不同,基因组中重复单位的数目存在差异,造成了品种间的多态性。可根据其两端的高度保守序列设计特异引物,通过PCR扩增及电泳检测,从而鉴定花生品种的纯度。 5 仪器设备 高压灭菌锅(105 136 ,最大工作压力0.22 MPa);凝胶自动扫描仪(400百万像素);高速冷冻离心机(最大离心力不小于15000 g);PCR扩
6、增仪(0 100 );紫外分光光度计(波长190 nm1100 nm);恒温水浴锅(室温99 );水平摇床(0 rpm230 rpm);微波炉(耐温120 );电子天平(最小显示0.01 g);电泳槽(样品通量1.0 mm厚);磁力搅拌器(0 r/min2500 r/min,室温100 );酸度计(-2.0020.000 pH);微量移液器(2 l、10 l、100 l、200 l、500 l和1000 l)。 6 试剂 乙二胺四乙酸钠(EDTA-Na2);三羟基甲基氨基甲烷(Tris);盐酸(HCl,36 %);十六烷基三甲基溴化铵(CTAB);氯化钠(NaCl);硼酸(Borate);丙烯
7、酰胺;甲叉双丙烯酰胺;四甲基乙二胺(TEMED);无水乙醇;过硫酸铵(APS);硝酸银(AgNO3);琼脂糖;6 loading buffer;Gold View染料; RNAase (10 ugL-1) ; 酚:氯仿:异戊醇 (体积比25:24:1) ; 异丙醇; 四硼酸钠; 甲醛; 2 Frements Mix;SSR引物(10 molL-1);20 bp DNA Ladder;重蒸水或符合GB/T 6682规定的一级水。除特殊说明外,所用试剂均为分析纯试剂。 7 溶液配制 相关溶液配制方法见附录A。 8 引物信息 推荐引物的序列信息与等位变异见附录B。 9 操作步骤 9.1 样品准备 鉴
8、定样品的分样和保存,应符合GB/T 3543.2的规定。随机取100粒花生种子,取其父母本材料各10份,另取参照品种(见附录C)各2粒。水培法种植,至第三片真叶长出后备用。 9.2 单粒种子的 DNA 提取 9.2.1 DNA 提取 取单株幼苗的根、茎、叶等器官50 mg,放入1.5 mL离心管中,液氮研磨。CTAB法提取基因组DNA,加入100 l 1 TE(pH 8.0)溶液溶解DNA。完全溶解后每管加入5 l RNAase,37 温育1 h,20 保存留用。 DB37/T 38012019 3 9.2.2 DNA 浓度和质量检测 测定DNA溶液的OD260/OD280值,确保在1.72.
9、0范围内。测定其OD260的吸光度,以1个OD260值相当于50 mgL-1 DNA浓度来计算纯化DNA的浓度。用0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性,Gold View染料进行染色。稀释至工作浓度为30 ngL-1,置于4 备用。 9.3 PCR 扩增 9.3.1 反应体系 总体系为10 L,包括1.5 L DNA,1.9 L水,5 L 2 Frements Mix,0.8 L F/R引物,混匀。 9.3.2 反应程序 95 预变性3 min;95 变性45 s,55 退火45 s,72 延伸45 s,进行35个循环;72 延伸5 min;4 保存备用。 9.4 PCR 产物检测 9.4
10、.1 非变性聚丙烯酰胺凝胶制备 9.4.1.1 玻璃板组装 清洗玻璃板和52齿梳,晾干;用95 %乙醇擦凹板和平板,两板间插入1.0 mm厚的边条,对齐,夹紧,凹板朝上,水平放置,用水平仪调平。 9.4.1.2 灌胶 在小烧杯中加入7.5 mL 6 %聚丙烯酰胺凝胶溶液、37 mL水,然后加500 L 10 %APS及20 L TEMED,轻轻摇匀,防止产生气泡;迅速灌胶,将梳子齿朝外,轻轻插入胶中,至凹板玻璃面约0.8 cm处,静置1 h。 9.4.2 电泳检测 9.4.2.1 玻璃板组装 将制好的胶板固定于垂直电泳槽上,凹板向内。上下槽中各加入1 TBE缓冲液,至下槽液面约为槽高的1/3,
11、上槽液面高于凹板玻璃面约1 cm。 9.4.2.2 清洗胶孔 拔去梳子,冲洗胶孔,赶走底层气泡和杂质。 9.4.2.3 上样 在10 L PCR产物中加入2 L 6 loading buffer,用微量移液器上样,每孔加入2 L PCR扩增产物;同时,在两侧样品孔中加入20 bp DNA Ladder分子量标记。 9.4.2.4 电泳 电压为200 V, 根据指示剂位置调整时间, 至青蓝色的二甲苯青指示剂到达胶板的2/3处, 停止电泳,电泳时间约2 h。 9.4.3 银染显色 DB37/T 38012019 4 9.4.3.1 水洗 电泳结束后,分开两块玻璃板取出凝胶,用水漂洗10 s20 s
12、,重复2次。 9.4.3.2 银染 转移至400 mL 0.1 % AgNO3溶液中,在摇床上轻摇10 min。 9.4.3.3 水洗 从染色液中取出,在水中快速漂洗2次,时长8 s10 s。 9.4.3.4 显影 转移至400 mL显色液中,在摇床上轻摇至带纹清晰,用水冲洗至溶液澄清。 9.4.3.5 成像 将凝胶置于凝胶成像工作台,选用透射UV光,调节focus至图像最清晰,保存。 10 判定方法与原则 10.1 判定方法 每个SSR位点的等位变异采用扩增片段长度的形式表示, 利用凝胶分析软件Quantity one读取条带。比较每份样品在每个位点的等位变异, 统计带型。 用具有本品种特异
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