DB37∕T 3802-2019 花生品种鉴定技术规程 SSR标记法(山东省).pdf
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1、ICS 65.020 B 04 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 38022019 花生品种鉴定技术规程 SSR 标记法 Protocol for identifying peanut varietySSR marker method 2019 - 12 - 24 发布 2020 - 01 - 24 实施 山东省市场监督管理局 发 布 DB37/T 38022019 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。 本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位:山东省花生研究所。 本标准主要起草人:闫彩霞、单世华、赵小
2、波、李春娟、王娟、苑翠玲、孙全喜、宋秀霞。 DB37/T 38022019 1 花生品种鉴定技术规程 SSR 标记法 1 范围 本标准规定了利用简单重复序列(Simple sequence repeat,SSR)标记法进行花生(Arachis hypogaea L.)品种鉴定的术语与定义、仪器设备、试剂与溶液配制、引物信息、鉴定方法、数据读取与判定方法。 本标准适用于花生品种的鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件, 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 3543.2 农作
3、物种子检验规程 扦样 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19557.1 植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 总则 NY/T 2237 植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 花生 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 简单重复序列 simple sequence repeat,SSR 由几个核苷酸(16个)为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp(一般为100200)的串联重复序列,又称微卫星序列或短串联重复序列,其多态性主要来源于串联数目的不同。 3.2 推荐引物 recommended primer 根据最少引物区分最多品种的原则筛选出的
4、一套SSR引物,具有条带清晰、多态性高、重复性好、均匀分布的特点,用于DNA分子数据的采集和品种鉴定。 3.3 参照品种 reference variety 具有推荐SSR位点上不同等位变异的花生品种, 用于辅助确定送检样品的等位变异扩增片段的大小,校正仪器设备的系统误差。 4 仪器设备 DB37/T 38022019 2 所用仪器设备见附录A。 5 试剂、溶液配制及引物信息 5.1 试剂及溶液配制 试剂及溶液配制见附录B(除特殊说明外,所用试剂均为分析纯)。 5.2 引物信息 推荐引物的相关信息见附录C。 6 鉴定方法 6.1 样品准备 6.1.1 样品为花生种子及其他植物组织。种子样品的分
5、样和保存,按照 GB/T 3543.2 的规定执行。 6.1.2 每份样品中至少随机抽取 10 个个体,每个个体单独分析。如样品为种子,水培法种植,至第三片真叶长出后备用。参照品种(见附录 D)各种植 2 粒,混合分析。 6.2 样品的 DNA 提取 6.2.1 DNA 提取 取花生幼嫩组织50 mg,放入组织破碎仪中,液氮研磨。十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取基因组DNA,室温风干,加入100 L 1TE(pH8.0)溶液溶解DNA。完全溶解后每管加入5 L RNAase,37 温育1 h,20 下保存留用。 6.2.2 DNA 浓度和质量检测 利用0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测DNA完
6、整性,Gold View染料进行染色。测定DNA溶液的OD260/OD280值,在1.82.0范围内最佳。测定其OD260的吸光度,以1个OD260值相当于50 mg/L DNA浓度来计算DNA的浓度。稀释至工作浓度为30 ng/L,置于4 下备用。 6.3 PCR 扩增 6.3.1 参照品种的使用 在进行PCR扩增和等位基因检测时,不同SSR引物的参照品种参见附录C。 6.3.2 反应体系 总体系为10 L,包括4.5 ng/L DNA,0.8 mol/L F/R引物,1Dream Taq Green PCR Master Mix,1.9 L蒸馏水,混匀。 6.3.3 反应程序 95 预变性
7、3 min;95 变性45 s,55 退火45 s,72 延伸45 s,进行35个循环;72 延伸5 min;4 下保存备用。 6.4 PCR 产物检测 DB37/T 38022019 3 6.4.1 玻璃板组装 清洗玻璃板和样品梳,晾干。用无水乙醇擦拭凹板和平板各2遍,待玻璃板彻底干燥后,将1.0 mm厚的塑料边条整齐摆放在平板两侧,盖上凹板,对齐,夹紧,用水平仪调平。 6.4.2 制胶 根据凝胶的面积和数量,调整6%聚丙烯酰胺凝胶溶液的用量,分别加入1 的APS和1 的TEMED,轻轻摇匀,防止产生气泡,迅速灌胶。待胶液充满玻璃板夹层,在上部凹面处轻轻插入样品梳平端,深度约0.8 cm。室
8、温下静置1 h,使胶液聚合,如室温较低可适当延长聚合时间。 6.4.3 电泳准备 将制好的胶板固定于垂直电泳槽上,凹板向内。上下槽中各加入1TBE缓冲液,至下槽液面约为槽高的1/3,上槽液面高于玻璃板凹面约1 cm。拔去梳子,冲洗胶孔,清除底层气泡和杂质。将样品梳齿端插入凝胶1 mm2 mm处。 6.4.4 上样 PCR产物中加入1/6体积的6loading buffer,微量移液器上样,每孔加入2 L PCR扩增产物(上样量可根据加样孔的大小适当调整)。20 bp DNA Ladder分子量标记加入两侧加样孔中,对应参照品种的PCR产物加入中间加样孔中,检测样品PCR产物加入其余加样孔中。
9、6.4.5 电泳 电压为200 V,根据指示剂位置调整时间,至青蓝色的二甲苯青指示带到达胶板底部,停止电泳,电泳时间一般为2 h。 6.5 银染显色 6.5.1 水洗 电泳结束后,分开两块玻璃板,取出凝胶,用蒸馏水快速漂洗2次,不超过10 s。 6.5.2 银染 将凝胶转移至适量染色液中,使其完全浸没,在摇床上轻摇10 min。 6.5.3 水洗 将凝胶从染色液中取出,在蒸馏水中快速漂洗2次,时长8 s10 s。 6.5.4 显影 将凝胶转移至适量显色液中,使其完全浸没,在摇床上轻摇至带纹清晰。 6.5.5 漂洗 将凝胶转移到蒸馏水中清洗,直至蒸馏水澄清。 6.6 成像 将凝胶置于凝胶成像系统
10、的工作台上,选用透射紫外光观察,调节至图像最清晰,保存。 DB37/T 38022019 4 7 数据读取与判定方法 7.1 数据读取 利用凝胶分析软件Quantity one读取条带,每个SSR位点的等位变异大小用扩增片段长度表示,单位为bp。与对应的参照品种进行比较,校正系统误差,确定送检样品在每个位点的等位变异大小,获得送检样品27个SSR位点的指纹图谱。 7.2 判定方法 根据送检样品与相应品种指纹图谱的差异位点数,对送检样品进行鉴定。 当送检样品与相应品种指纹图谱的差异位点数2,则判定为“不同品种”; 当差异位点数=1,判定为“近似品种”; 当差异位点数=0,判定为“疑同品种”。 对
11、于差异位点数1个的送检样品,应按GB/T 19557.1给出的原则和NY/T 2237给出的方法进行田间测试,确定送检样品在表型性状上是否与对应品种一致。 DB37/T 38022019 5 A A 附 录 A (规范性附录) 仪器设备 A.1 组织破碎仪 温控范围为40 室温。 A.2 高压灭菌锅 灭菌温度为105 136 ,最大工作压力为0.22 MPa。 A.3 凝胶成像系统 分辨率不低于400百万像素。 A.4 高速冷冻离心机 最大离心力不小于15 000 g。 A.5 PCR扩增仪 控温范围为0 100 。 A.6 紫外可见分光光度计 波长范围为190 nm1 100 nm。 A.7
12、 恒温水浴锅 温度范围为室温99 。 A.8 水平摇床 转速为0 rpm230 rpm。 A.9 微波炉 最高耐温120 。 A.10 电子天平 DB37/T 38022019 6 精确到0.01 g。 A.11 电泳槽 样品通量为1.0 mm厚。 A.12 磁力搅拌器 转速为0 r/min2 500 r/min,控温范围为室温100 。 A.13 酸度计 测量范围为0.00 pH14.00 pH。 A.14 微量移液器 量程分别为2 L、10 L、100 L、200 L、500 L和1 000 L。 DB37/T 38022019 7 B B 附 录 B (规范性附录) 试剂及溶液配制 B.
13、1 试剂 B.1.1 乙二胺四乙酸钠(EDTA-Na2) 。 B.1.2 三羟基甲基氨基甲烷(Tris) 。 B.1.3 盐酸(HCl,36 %) 。 B.1.4 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 。 B.1.5 氯化钠(NaCl) 。 B.1.6 硼酸(Borate) 。 B.1.7 丙烯酰胺。 B.1.8 甲叉双丙烯酰胺。 B.1.9 四甲基乙二胺(TEMED) 。 B.1.10 无水乙醇。 B.1.11 过硫酸铵(APS) 。 B.1.12 硝酸银(AgNO3) 。 B.1.13 琼脂糖。 B.1.14 6loading buffer。 B.1.15 Gold View染料。 B.1.1
14、6 RNAase(10 mg/mL) 。 B.1.17 酚:氯仿:异戊醇(体积比25:24:1) 。 B.1.18 异丙醇。 B.1.19 四硼酸钠。 B.1.20 甲醛。 B.1.21 2Dream Taq Green PCR Master Mix。 B.1.22 SSR引物(10 mol/L) 。 B.1.23 20 bp DNA Ladder。 B.1.24 重蒸水或符合GB/T 6682规定的一级水. B.2 溶液配制 B.2.1 1mol/L NaOH 4 g NaOH,加蒸馏水定容至100 mL。 B.2.2 1mol/L Tris-Cl(pH8.0)溶液 称取121.1 g Tr
15、is,加蒸馏水定容至1 L,浓盐酸调至pH8.0,高压灭菌备用。 B.2.3 0.5mol/L EDTA(pH8.0)溶液 DB37/T 38022019 8 称取186.1 g EDTA-Na2,800 mL蒸馏水,加热定容至1 L,1 mol/L NaOH调至pH8.0,高压灭菌备用。 B.2.4 1TE 1 mL 1 mol/L Tris-HCl(pH8.0),0.2 mL 0.5 mol/L EDTA(pH8.0),加蒸馏水定容至100 mL。 B.2.5 DNA提取液 4 g CTAB,16.364 g NaCl,20 mL 1 mol/L Tris-Cl(pH8.0),8 mL 0
16、.5 mol/L EDTA(pH8.0),加蒸馏水定容至200 mL,4 条件下保存。使用前加入2 %的巯基乙醇,实验前预热至65 。 B.2.6 70 %乙醇 700 mL无水乙醇,加蒸馏水定容至1 L。 B.2.7 10TBE缓冲液 分别称取108 g三羟基氨基甲烷,55 g硼酸,加入800 mL蒸馏水加热溶解,再加入0.5 mol/L EDTA(pH8.0)溶液37 mL,加蒸馏水定容至1 L。 B.2.8 1TBE缓冲液 100 mL 10TBE,加蒸馏水定容至1 L。 B.2.9 10 %APS 0.5 g APS溶于5 mL蒸馏水中。 B.2.10 6 %聚丙烯酰胺凝胶溶液(29:
17、1) 分别称取58 g丙烯酰胺,2 g甲叉双丙烯酰胺,100 mL 10TBE,加蒸馏水定容至1 L,4 条件下保存。 B.2.11 染色液 称取1 g硝酸银,加蒸馏水定容至1 L。 B.2.12 显色液 6 g NaOH,0.2 g四硼酸钠,1.6 mL甲醛,加蒸馏水定容至400 mL。 DB37/T 38022019 9 C C 附 录 C (资料性附录) 推荐引物 推荐引物见表C.1。 表C.1 推荐引物 引物 连锁群 引物序列(53) 常见等位变异(bp) 参照品种 Ah1TC5A06 A07 F-tcggtttgggagacactctt R-ttgtaagcagacgccacatc
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