碱裂解法提取质粒.ppt
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1、碱裂解法提取质粒DNA 通过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、测定,学习用碱变性法提取质粒DNA的方法,掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理及操作。一、实验目的一、实验目的质粒(Plasmid):质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子,能稳定地独立存在于染色体外,并传递到子代,一般不整合到宿主染色体上。在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中,在细菌细胞中最多。二、实验原理二、实验原理质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子,具有以下特点:易于鉴定;易于鉴定;在受体细胞中可以独立复制;在受体细胞中可以独立复制;易于筛选;易于筛选;易于导入受体
2、细胞。易于导入受体细胞。二、实验原理二、实验原理高碱高碱细菌的细胞壁破裂,内容物释放细菌的细胞壁破裂,内容物释放染色体染色体DNADNA断裂成不同长度的线性双链断裂成不同长度的线性双链DNADNA;线性双链线性双链DNADNA片段中的氢键断裂,双链解离变性。片段中的氢键断裂,双链解离变性。质粒质粒DNADNA不发生断裂,保持双链闭合环状;不发生断裂,保持双链闭合环状;双链双链DNADNA并不完全分离。并不完全分离。高酸高酸中和中和至中至中性性变性的染色体变性的染色体DNADNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物成网络状大分子不溶性沉淀物质粒质
3、粒DNADNA又恢复天然构型,溶解在上清液中又恢复天然构型,溶解在上清液中纯化纯化RNARNA酶消化除去酶消化除去RNARNA,并用酚抽提法除去残留的蛋白质,并用酚抽提法除去残留的蛋白质 SDS是一种阴离子表面活性剂,它既能使细菌细胞裂解,又能使一些蛋白质变性,所以SDS处理细菌细胞后,会导致细菌细胞壁的破裂,从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性(NaOH)环境,就会变性。然后,用酸性乙酸钾来中和溶液,使溶液处于中性,质粒DNA将迅速复性,而基因组DNA,由于分子巨大,难以复性。离心后,质粒DNA将在上清中,而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管
4、的底部。通过这种方法即可 将 质 粒D N A从 细 菌 中 提 取 出 来。THANKYOUSUCCESS2024/5/7周二8可编辑三、主要试剂及作用三、主要试剂及作用溶液溶液:由葡萄糖、:由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl组成组成(保护、缓冲保护、缓冲)葡萄糖葡萄糖的作用是增加溶液的粘度的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的减少抽提过程中的机械剪机械剪切作用切作用,防止破坏质粒防止破坏质粒(保护作用保护作用)EDTA的作用是络合掉镁等二价金属离子的作用是络合掉镁等二价金属离子,防止防止DNA酶对质酶对质粒分子的降解作用(保护作用)粒分子的降解作用(保护作用)Tris-HCl使溶菌液维
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