DB34∕T 3101-2018 猕猴桃溃疡病菌检疫鉴定方法(安徽省).pdf
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1、ICS 65.020.20 B 16 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 31012018 猕猴桃溃疡病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Pseudomonas syringae pv. actinidae 文稿版次选择 2018 - 04 - 16 发布 2018 - 05 - 16 实施安徽省质量技术监督局发 布 DB34/T 31012018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所提出。 本标准由安徽省动植物检验检疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单
2、位: 安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所、 安徽省检验检疫科学技术研究院、安徽省农业科学院园艺研究所。 本标准主要起草人:杨雪、陈雨、高同春、戚仁德、姚剑、齐永杰、张金云、伊兴凯、张爱芳、谷春艳、李云飞、臧昊昱。 DB34/T 31012018 1 猕猴桃溃疡病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了猕猴桃溃疡病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于猕猴桃的苗木、枝叶、花蕾中猕猴桃溃疡病病菌的检疫和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件, 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 G
3、B/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 猕猴桃溃疡病菌的基本信息 3.1 病原菌:丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv. actinidae) 3.2 分类地位:属细菌界 Bacteria,蛋白菌门 Proteobacteria,变形菌纲 Gamma Proteobacteria,假单胞目 Pseudomonadales,假单胞科 Pseudomonadaceae,假单胞属Pseudomonas。其他信息参见附录A。 4 方法原理 本方法以 PCR 鉴定和致病性鉴定为主要判定依据, 猕猴桃溃疡病菌的形态特征作为辅助鉴定依据。 5 仪器设备 5.
4、1 高速离心机:转速15000 r/min 5.2 涡旋振荡器 5.3 PCR 仪 5.4 高压灭菌锅 5.5 恒温培养箱:2030 5.6 冰箱:4、-20、-70 5.7 恒温水浴锅:4100 5.8 电泳仪 5.9 凝胶成像仪 5.10 可调移液器:1-10L,10L-100L,100L-1000L 5.11 天平:精度 0.001 g 5.12 纯水仪 5.13 超净工作台 DB34/T 31012018 2 6 试剂和培养基 除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂,实验用水符合 GB/T 6682 中三级水的标准。 6.1 PCR 试剂:2PCR Taq Master Mix 6
5、.2 凝胶电泳试剂:琼脂糖、TAE 电泳缓冲液(参见附录 B.1) 6.3 培养基:细菌培养基(参见附录 B.2) 7 实验室鉴定 7.1 病原菌分离与纯化 将疑似猕猴桃溃疡病的发病组织用 70乙醇表面消毒后,挑取少许病健交界处的新鲜病组织放到无菌的培养皿中,加入 0.5 mL 的无菌水,用玻璃棒碾碎后静置 30 min,在细菌培养基上划线培养。28培养 23 d 后,挑取乳黄色单菌落用液体细菌培养基摇培,28培养 1 d ,-20保存备用。 7.2 PCR 鉴定 7.2.1 病原菌 DNA 提取 采用商业化试剂盒提取疑似分离细菌 DNA。 7.2.2 PCR 引物 引物序列为: Psaf1
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