DB45∕T 2755-2023 百香果品种鉴定技术规程 SSR分子标记法(广西壮族自治区).pdf
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1、 ICS 65.020.20 CCS B 05 45 广西壮族自治区地方标准 DB45/T 27552023 百香果品种鉴定技术规程 SSR 分子标记法 Code of practice identification of passion fruit varieties by SSR molecular marker method 2023-08-10 发布 2023-09-30 实施 广西壮族自治区市场监督管理局 发 布 DB45/T 27552023 I 目次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 缩略语.1 5 原理.2 6 材料和试剂.2 一般规定.
2、2 6.1 试剂.2 6.2 溶液配制.2 6.3 7 仪器和设备.3 8 SSR 引物序列信息.3 9 操作步骤.4 样品采集.4 9.1 DNA 提取.4 9.2 PCR 扩增.4 9.3 PCR 产物检测.4 9.4 10 数据记录与统计.5 数据记录.5 10.1 统计.5 10.2 11 结果判定.6 判定方法.6 11.1 结果表述.6 11.2 附录 A(规范性)引物序列信息.7 DB45/T 27552023 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识
3、别专利的责任。本文件由广西检验检疫标准化技术委员会提出、归口并宣贯。本文件起草单位:广西益谱检测技术有限公司、广西博测检测技术服务有限公司、广西绿保环境监测有限公司、广西智标云信息科技有限公司、南宁海关技术中心、广西壮族自治区种子管理站、百色市检验检测中心、南宁维尔凯生物科技有限公司。本文件主要起草人:赵永锋、姚振光、何京明、黎保序、朱秋莲、莫璋红、苏丽梅、薛海燕、梁俊、黄小娟、王丹、劳苏海、莫薇、黄鹂、郑美玲、官月香、韦仁矿、韦东、黄芳、刘守廷。DB45/T 27552023 1 百香果品种鉴定技术规程 SSR 分子标记法 1 范围 本文件界定了百香果品种鉴定技术的相关术语和定义,规定了利用
4、简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)分子标记法进行百香果品种鉴定的原理、材料和试剂、仪器设备、引物序列信息、操作步骤、数据记录和统计、结果判定。本文件适用于广西壮族自治区行政区域内基于SSR分子标记的百香果品种SSR指纹数据采集和品种鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 2594 植物品种鉴定 DNA分子标记法 总则 3 术语和定义
5、NY/T 2594界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1 核心引物 core primer 品种鉴定中优先选用一套简单重复序列(SSR)引物,其检测位点具有多态性高、重复性好等综合特性。3.2 对照品种 control variety 具有所用SSR位点上不同等位变异的特性,用于辅助确定待测样品的等位变异,校正仪器设备的系统误差的一类品种。3.3 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction 利用DNA在体外摄氏95 高温时变性会变成单链,低温(经常是60 左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72 左右),DNA聚合酶沿着
6、磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互补链。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。SSR:简单重复序列(Simple Sequence Repeat)。PCR:聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)。DB45/T 27552023 2 DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyribo Nucleic Acid)。5 原理 不同品种百香果的基因组成不同,其基因组中SSR的重复次数存在差异,根据SSR的差异,通过PCR扩增及电泳技术可以鉴定百香果品种。6 材料和试剂 一般规定 6.1 除另有说明外,本文件中使用分析纯(含)以上试剂,水为符合GB/T 6682规定的二级水,其中PCR
7、用水要求达到一级水指标。试剂 6.2 6.2.1 三羟甲基氨基甲烷(C4H11NO3):纯度99.0。6.2.2 乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na):纯度99.0。6.2.3 硼酸(H3BO3):=1.43 g/cm,含量99.5。6.2.4 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB):=1.32 g/mL,纯度99.0。6.2.5 氯化钠(NaCl):=2.165 g/cm,含量99.5。6.2.6 琼脂糖。6.2.7 过硫酸铵((NH4)2S2O8):=1.98 g/cm,含量98.0。6.2.8 氢氧化钠(NaOH):=2.13 g/cm,含量96.0。6.2.9 硝酸银(AgNO3):=4.3
8、5 g/cm,含量98.0。6.2.10 甲醛(HCHO):=0.815 g/cm。6.2.11 液氮(N2):=0.81 g/cm。6.2.12 三氯甲烷(CHCl3):=1.50 g/cm。6.2.13 无水乙醇(CH3CH2OH):=0.79 g/cm,含量99.7。6.2.14 DNA 分析仪用 LIZ 500 分子量内标。6.2.15 去离子甲酰胺(CH3NO):=1.133 g/mL。6.2.16 40丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液(Acryl/Bis Solution(29:1))。6.2.17 四甲基乙二胺(TEMED):=1.32 g/mL。6.2.18 DNA 分子量标准(D
9、NA marker):可以清楚区分 50 bp500 bp 的 DNA 片段。6.2.19 2 Taq Plus PCR 预混试剂:0.1 U/L Taq Plus Polymerase、500 mol/L dNTP each、20 mmol/L Tris-HCl(pH=8.3)、100 mmol/L KCl、3 mmol/L MgCl2、稳定剂、增强剂。溶液配制 6.3 6.3.1 5TBE 缓冲液 称取5.40 g三羟甲基氨基甲烷(6.1.1)、0.372 g 乙二胺四乙酸二钠(6.1.2)和2.75 g硼酸(6.1.3)溶于70 mL一级水中,定容至100 mL,在103.4 kPa(1
10、21)条件下灭菌20 min。6.3.2 0.5TBE 缓冲液 量取100 mL浓度5TBE(6.2.1)缓冲液于烧杯中,加入900 mL一级水混匀。DB45/T 27552023 3 6.3.3 CTAB 提取溶液 称取4.00 g十六烷基三甲基溴化铵(6.1.4)、16.38 g氯化钠(6.1.5)、1.21 g三羟甲基氨基甲烷(6.1.1)、1.49 g 乙二胺四乙酸二钠(6.1.2)溶于70 mL一级水,定容至200 mL,在103.4 kPa(121)条件下灭菌20 min。6.3.4 无菌一级水 一级水在103.4 kPa(121)条件下灭菌20 min。6.3.5 1琼脂糖溶液
11、1 g琼脂糖(6.1.6)溶于100 mL的0.5TBE缓冲液(6.2.2),适当加热融化。6.3.6 10过硫酸铵溶液 称取10 g过硫酸铵(6.1.7),加入100 mL一级水溶解。6.3.7 电泳缓冲液 称取108 g三羟甲基氨基甲烷(6.1.1)、7.44 g乙二胺四乙酸二钠(6.1.2)、55 g硼酸(6.1.3)、0.80 g氢氧化钠(6.1.8),加入10 L一级水溶解。6.3.8 染色液 称取0.2 g硝酸银(6.1.9),加入400 mL一级水溶解。6.3.9 显色液 称取4.0 g氢氧化钠(6.1.8),加入400 mL一级水溶解,临用时再加1.6 mL甲醛(6.1.10)
12、。7 仪器和设备 电子天平:感量为 1 mg。7.1 水浴锅。7.2 高速冷冻离心机。7.3 PCR 扩增仪。7.4 垂直板电泳系统。7.5 凝胶成像系统。7.6 毛细管电泳仪。7.7 胶片观察灯。7.8 涡旋振荡仪。7.9 8 SSR 引物序列信息 引物序列信息按附录A。DB45/T 27552023 4 9 操作步骤 样品采集 9.1 随机取5个单株,用不锈钢剪刀采集种植的待测品种的百香果嫩叶放入塑料样品袋中,做好标识,放入0 8 保温箱中,带回实验室,于-18 及以下条件保存。DNA 提取 9.2 称取9.1中1 g2 g百香果叶片用自来水冲洗干净,再用一级水冲洗两遍,自然晾干后用不锈钢
13、剪刀剪碎放入研钵中,加入液氮(6.1.11)研磨成粉末状,称取100 mg放入1.5 mL离心管中,加入750 L CTAB提取溶液(6.2.3),涡旋振荡混匀后于65 水浴45 min60 min,期间每隔15 min颠倒离心管混匀;加入500 L的三氯甲烷(6.1.12),颠倒混匀,12 000 r/min 离心3 min,转移上清液约0.5 mL至新离心管中,加入等体积(即0.5 mL)预冷至约4 的无水乙醇(6.1.13),颠倒混匀,-18 下静置1 h,12 000 r/min 离心3 min,弃去上清液,室温下挥干沉淀。加入50 L无菌一级水(6.2.4)混匀后于-18 及以下条件
14、保存。注:以上为推荐的DNA提取方法。其他能够达到PCR扩增质量的DNA提取方法也适用于本文件。PCR 扩增 9.3 9.3.1 PCR 反应体系 PCR反应体系参见表1。表1 PCR 反应体系 试剂 终浓度 体积 L 灭菌一级水-8.5 2 Taq Taq Plus PCR预混试剂 1 12.5 10 mol/L正向引物 0.4 mol/L 1.0 10 mol/L反向引物 0.4 mol/L 1.0 25 ng/L DNA模板 2.0 ng/L 2.0 总体积-25.0 9.3.2 PCR 反应程序 94 预变性5 min;94 变性30 s,退火30 s(退火温度按附录A),72 延伸3
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