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生物芯片分析.ppt
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1、Bioinformatics,2010-2011 Bioinformatics,2010-2011 生物芯片生物芯片(Biochip)武汉大学生物医学工程系武汉大学生物医学工程系赵赵 旻旻Bioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011本章提纲本章提纲r生物芯片简介与沿革r生物芯片的分类r基因芯片基本原理、流程与应用r蛋白质芯片及应用r其它芯片技术Bioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011第一节 生物芯片简介与沿革什么是生物芯片?生物芯片(Biochip)主要指通过平面微细加工技术,在固体芯片
2、表面等载体上的微型生物化学分析系统,以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。Bioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011 芯片上每平方厘米可密集排列成千上万个生物分子(Microarray),能快速准确地检测细胞、蛋白质、DNA及其他生物组分,并获取样品中的有关信息,其效率是传统检测方法的成百上千倍。Bioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011生物芯片分析基本流程试样处理试样处理点阵固定点阵固定反应或杂交芯片制作标记洗涤检测扫描检测扫描光刻合成微量点样喷墨纯化
3、、标记光化学检测电化学检测计算处理Bioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011建立建立r1996年美国Affymetrix公司成功地制作出世界上首批用于药物筛选和实验室试验用的生物芯片,并制作出相应的芯片系统。此外,美国的Hyseq公司、Aurora公司、Nanogen公司、Incyte公司等也在积极开展DNA芯片研究工作。近二年,摩托罗拉、惠普、IBM等跨国公司也相继投以巨资加入生物芯片的研究开发。Bioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011r中国在生物芯片领域起步较晚,我国是从一九九七年
4、才开始对生物芯片研究,而国外从八十年代起就开始研制生物芯片。r中国医药生物技术协会生物芯片分会国际生物芯片领域的第一个行业性组织2006在北京成立。r中国在北京、上海、陕西、天津、南京建立了五大生物芯片研发和产业化基地。r我国生物芯片产业尚未形成统一的技术标准,不规范。在产品认证认可方面也存在与国际惯例不接轨的情况。Bioinformatics,2010-2011 Bioinformatics,2010-2011 第二节 生物芯片的分类Bioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011一般分类一般分类Bioinformatics,2010-2011
5、Bioinformatics,2010-2011根据用途还可以把生物芯片分为两类:根据用途还可以把生物芯片分为两类:信息生物芯片信息生物芯片和和功能生物芯片功能生物芯片Bioinformatics,2010-2011 Bioinformatics,2010-2011 第三节第三节 基因芯片基因芯片 基本原理、流程与应用Bioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011本本节节内容提要内容提要1.简介简介2.图像处理与数据标准化图像处理与数据标准化3.基因芯片的数据分析基因芯片的数据分析4.芯片芯片工具工具&数据库数据库Bioinformatics,
6、2010-2011Bioinformatics,2010-2011简介简介基因芯片基因芯片(Gene chip)技技术术是指通是指通过过微微阵阵列列(Microarray)技技术术将高密度将高密度DNA片段片段阵阵列通列通过过高速机器人或原位合成方式以一定的高速机器人或原位合成方式以一定的顺顺序序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面,或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面,以以荧荧光光标记标记的的DNA探探针针,借助碱基互,借助碱基互补杂补杂交交原理,原理,进进行大量的基因表达及行大量的基因表达及检测检测等研究的等研究的技技术术。Bioinformatics,2010-2011Bioinfo
7、rmatics,2010-2011基因芯片发展历史基因芯片发展历史Southern&Northern Southern&Northern BlotBlotDot Dot BlotBlotMacroarrayMacroarrayMicroarrayMicroarrayBioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011基因芯片基因芯片1.根据免疫测定的根据免疫测定的(immunoassay)的方法的方法 予以改进予以改进2.高通量、点阵以及高通量、点阵以及Northern杂交杂交3.同时测定细胞内数千个基因的表达情况同时测定细胞内数千个基因的表达情况4
8、.芯片的体积非常小:微量样品的检测芯片的体积非常小:微量样品的检测5.基因表达情况的定量分析基因表达情况的定量分析Bioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011基因芯片的原理基因芯片的原理 依据双螺旋原理,核酸分子依据双螺旋原理,核酸分子杂杂交技交技术术,在靶在靶标样标样品与探品与探针针之之间进间进行行选择选择性反性反应应,将反将反应应一方一方(探探针针)固定在芯片上,另一方固定在芯片上,另一方(荧荧光光标记标记,即制即制备备好的好的cDNA,分,分别标记绿别标记绿色的色的Cy3和和红红色的色的Cy5)通通过过流路或加至芯流路或加至芯片上。片上
9、。Bioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011核酸杂交核酸杂交RNADNA1DNA2ProbeSouthernhybridizationNorthernhybridizationJuang RH(2004)BCbasicsBioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011基因芯片的密度:基因芯片的密度:100-1 million DNA 探针探针/1cm2将样品中的将样品中的DNA/RNA表上荧表上荧光标记,则可以定量检验基光标记,则可以定量检验基因的表达水平因的表达水平碱基互补碱基互补Bioin
10、formatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011基因芯片流程基因芯片流程样品制备样品制备芯片制备芯片制备杂交杂交杂交信号检测杂交信号检测数据分析数据分析Bioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011实验流程实验流程Bioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011基因表达情
11、况的定量测定基因表达情况的定量测定1.发现在特定生长时期,或者随着环境变化,那些发现在特定生长时期,或者随着环境变化,那些基因的表达收到诱导或者抑制基因的表达收到诱导或者抑制2.在相同条件下,上调或者下调变化规律相似的基在相同条件下,上调或者下调变化规律相似的基因,可能具有功能上的关联因,可能具有功能上的关联3.可以从共表达的基因中寻找调控模体可以从共表达的基因中寻找调控模体4.基因表达的模式可以用来表征异常的细胞调控,基因表达的模式可以用来表征异常的细胞调控,例如,癌症的诊断例如,癌症的诊断Bioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011基因芯
12、片分类基因芯片分类r按芯片制备方法分类按芯片制备方法分类 原位合成芯片(原位合成芯片(synthetic genechip)DNA微阵列芯片(微阵列芯片(DNA microarray)r按探针分类按探针分类 寡核苷酸阵列(芯片)寡核苷酸阵列(芯片)DNA阵列阵列 基因芯片基因芯片 cDNA芯片芯片 RNA芯片芯片Bioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011Comparison of DNA Chip Technologies Sensitivity of DNA chip based assays is a function of:|Prob
13、e and target DNA/RNA(Complexity)|Chip surface(autofluorescence&non-spec.bkg)|Attachment chemistry/methodology(hyb.efficiency&crosshyb.)|Hybridization efficiency(lots of factors)|Detection technology(signal type,efficiency,noise)Oligo-Chip Oligo-Chip cDNA-Chip cDNA-Chip Genomic Chip Genomic Chip 8 n
14、or 20 n 8 n or 20 n 50,000 n 50,000 nsequencingsequencingexpressionexpressionexpressionexpressiongenomic analysisgenomic analysisBioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011基因芯片技术的类型基因芯片技术的类型按技术手段、探针类型分类按技术手段、探针类型分类1.Short oligonucleotide arrays(Affymetrix)2.cDNA arrays(Brown/Botstein)3.Long oli
15、go arrays(Agilent)4.Serial analysis of gene expression(SAGE)按实验要求分类按实验要求分类1.单通道单通道(Single Channel):一次检验一种状态一次检验一种状态 2.双通道双通道(Dual Channel):差异表达基因的筛选差异表达基因的筛选Bioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-20111 片上原位合成寡核苷酸点阵芯片(片上原位合成寡核苷酸点阵芯片(ONA)2 微量点样技术制作的微量点样技术制作的CDNA 点阵芯片(点阵芯片(CDA)ONA特点特点:(1)易寻址,易寻址,利
16、用组合化学的原理安排各寡核苷酸利用组合化学的原理安排各寡核苷酸的位点,芯片反应后易寻址;的位点,芯片反应后易寻址;(2)点位牢固,)点位牢固,用表面化学方法处理基片用表面化学方法处理基片(玻璃、玻璃、硅片、尼龙片硅片、尼龙片),使核苷酸固定在基片上;,使核苷酸固定在基片上;(3)定点合成,)定点合成,光导向平板印刷技术,芯片表面可光导向平板印刷技术,芯片表面可用屏蔽物屏蔽,光照选择性脱保护,有利于定点用屏蔽物屏蔽,光照选择性脱保护,有利于定点合成寡核苷酸中的各个碱基;目前技术:合成寡核苷酸中的各个碱基;目前技术:1.6cm2;40万个点;万个点;20个个核苷酸;核苷酸;Bioinformati
17、cs,2010-2011Bioinformatics,2010-2011两类主流的两类主流的DNA芯片芯片1.cDNA microarrays:将将5005,000bp的的cDNA固固载到介质上载到介质上(例如玻璃例如玻璃),Stanford开发设计,通开发设计,通常为双通道常为双通道2.DNA chips:将寡核苷酸探针将寡核苷酸探针(2080-mer)合成合成到芯片上,到芯片上,Affymetrix开发设计,通常为单通道开发设计,通常为单通道Bioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011(1)cDNA microarrayscDNA clo
18、nesBioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011Robot spotter普通的盖玻片普通的盖玻片cDNA microarrays的制备的制备Bioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011差差异表达基因的筛选异表达基因的筛选Treatment/controlNormal/tumor tissueBrain/liverBioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011点样后的点样后的cDNA MicroarraysBioinformatics,20
19、10-2011Bioinformatics,2010-2011GenesmRNA samplesGene expression level of gene i in mRNA sample j=Log(Red intensity/Green intensity)Log(Avg.PM-Avg.MM)sample1 sample2 sample3 sample4 sample5 1 0.46 0.30 0.80 1.51 0.90.2-0.10 0.49 0.24 0.06 0.46.3 0.15 0.74 0.04 0.10 0.20.4-0.45-1.03-0.79-0.56-0.32.5-0
20、.06 1.06 1.35 1.09-1.09.基因表达的数据基因表达的数据Bioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011(1)DNA chipsBioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011DNA chips的制备:的制备:Affymetrix photolitographyr探针长度:探针长度:25 bpr每个基因:每个基因:22-40个探针个探针rPerfect Match(PM)vs.MisM
21、atch(MM)probesBioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011点样后的点样后的Gene chipBioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011总结总结Bioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011基因芯片的实验流程基因芯片的实验流程Bioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-20112.图像处理与数据标准化图像处理与数据标准化单单通道基因芯片通道基因芯片 white(very high)re
22、d(high)Yellow(a little high)green(medium)blue(low)black(no)Bioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011图像处理图像处理植根区域生长法植根区域生长法(SRG)Fixed Circle1.栅格化:确定点的位置栅格化:确定点的位置2.图象分割图象分割(Segmentation):将点从背景中分离出来。:将点从背景中分离出来。3.抽提亮度:各个像素亮度的平均值抽提亮度:各个像素亮度的平均值(mean)或中位数或中位数(median)4.背景校正:局部或全局背景校正:局部或全局Bioinfor
23、matics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011基因表达量的定量基因表达量的定量对于每个点,我们可以计算对于每个点,我们可以计算 Red intensity =Rfg-Rbgfg=foreground,bg=background,and Green intensity=Gfg-Gbgand combine them in the log(base 2)ratio Log2(Red intensity/Green intensity)Green intensity(medium):1Bioinformatics,2010-2011Bioinformatics,20
24、10-2011Microarray:误差的来源误差的来源r系统的系统的r随机的随机的 log signal intensity log RNA abundanceBioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011Microarray:误差的来源误差的来源1.图图像分析像分析2.扫扫描描3.DNA杂杂交交过过程程,温度、温度、时间时间、混合均匀程度等、混合均匀程度等4.探探针针的的标记标记5.RNA的抽提的抽提6.加加样样7.其他其他Bioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011Red/green 比
25、值比值存在亮度的倾向存在亮度的倾向M=log2R/G =log2R-log2G=(log2R+log2G)/2Values should scatter about zero.Bioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-2011数据标准化数据标准化beforeafterBioinformatics,2010-2011Bioinformatics,2010-20113.基因芯片的数据分析基因芯片的数据分析(1)差异表达基因的分析差异表达基因的分析(2)基因共表达分析基因共表达分析(3)基因表达数据的聚类基因表达数据的聚类(4)基因表达数据的分类基因表达
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