DB37∕T 3128.2-2020 Ⅰ群禽腺病毒感染诊断技术 第2部分:血清4型Ⅰ群禽腺病毒感染PCR和荧光定量PCR诊断技术.doc
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1、ICS65.020.30B41DB37山东省地方标准DB37/T 3128.22020群禽腺病毒感染诊断技术第2部分:血清4型群禽腺病毒感染PCR和荧光定量PCR诊断技术Diagnostic techniques for fowl adenovirus group IPart 2: Detection method on fowl adenovirus group I serotype 4 by PCR and quantitative real-time PCR2020-06-08发布2020-07-08实施山东省市场监督管理局 发布前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标
2、准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位:山东农业大学。本标准主要起草人:刁有祥、唐熠、杨晶、王鸿志、陈浩、冯强、张吉、宋存鑫、李伟。群禽腺病毒感染诊断技术第2部分:血清4型群禽腺病毒感染PCR和荧光定量PCR诊断技术1 范围本标准规定了血清4型群禽腺病毒聚合酶链式反应(PCR)与实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法的范围、规范性引用文件、术语和定义、实验室要求、样品、结果判定等。本标准所规定的血清4型群禽腺病毒PCR与实时荧光定量PCR检测方法适用于检测鸡组织、分泌物、排泄物和鸡胚尿囊液及细胞培养液中血清4型群禽腺病毒的核酸,也适用于鸭、
3、鹅及鸭胚、鹅胚尿囊液血清4型群禽腺病毒核酸的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB 19489实验室生物安全通用要求GB/T 27401实验室质量控制规范动物检疫3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1血清4型群禽腺病毒Fowl adenovirus group I Serotype 4是引起禽心包积水-肝炎综合征的病原,主要造成3周龄5周龄家禽突然死亡,并伴随有心包积水和肝炎。3.2实时荧光定量
4、PCRQuantitative Real-time PCR(qPCR)通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。4 实验室要求4.1 环境4.1.1 实验室符合GB19489和GB/T 27401要求,实验室必须为生物安全级(BSL-2级)及以上实验室。4.1.2 从事PCR工作的实验室应进行分区,根据条件划分出前处理区、核酸提取区、核酸扩增区、电泳检测区,形成有效的物理隔离,且为单一流向,不得倒流。特别注意电泳后的琼脂凝胶要及时处理,避免对实验室造成污染。4.1.3 生物样品应严格控制对
5、环境的污染,试验结束后应将相关样品收集高压灭菌后,送有资质的医用垃圾处理公司做处理。4.2 人员操作人员应接受实验室生物安全、实验室质量管理、细胞培养和分子生物学实验室检测技术培训。熟悉生物样品处理、细胞培养、以及核酸提取、基因扩增等分子生物学技术,熟悉PCR与qPCR检测结果的判断方法。4.3 仪器设备4.3.1 生物安全柜。4.3.2 PCR仪(温度差小于0.3 )。4.3.3 台式低温高速离心机(最大转速为15000 rpm)。4.3.4 电泳仪。4.3.5 电泳槽。4.3.6 紫外凝胶成像仪。4.3.7 冰箱:2 8 。4.3.8 冰柜:-20 。4.3.9 微量移液器(最大量程分别为
6、10 L、20 L、100 L、1000 L),带滤芯的枪头。4.3.10 电子天平:精度为0.001 g。4.3.11 电磁炉或微波炉。4.3.12 荧光定量PCR仪。4.4 试剂或材料除另有规定外,所有生化试剂均为分析纯,水符合GB/T 6682规定的一级水。4.4.1 DNA提取试剂盒。4.4.2 rTaq DNA聚合酶:5U/L。4.4.3 10PCR 缓冲液。4.4.4 dNTPs:2.5 mmol/L, 10 mmol/L。4.4.5 荧光定量PCR试剂盒。4.4.6 1.5%琼脂糖凝胶,见附录A.1。4.4.7 1TAE缓冲液,见附录A.2。4.4.8 溴化乙锭(10 g/L),
7、见附录A.3。4.4.9 核酸电泳加样缓冲液,见附录A.4。4.4.10 DNA分子量标准,要求在100 bp2000 bp之间,有5条以上的指示条带。4.4.11 阳性对照标准品,已知的血清4型群禽腺病毒SPF鸡胚尿囊液。4.4.12 阴性对照标准品,经高压灭菌的超纯水。4.4.13 PCR检测所需引物: 上游引物F:5-CTCTTCGACCTCGTGTCTTACA-3; 下游引物R:5-TTTACACGGCGTTGCCTGT-3,扩增片段长度为568bp,引物浓度为100 mol/L。4.4.14 荧光定量PCR检测所需引物: 上游引物1983F:5-CGTCAACTTCAAGTACTC-
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