DB37∕T 3560-2019 荷斯坦牛致死单倍型(HH1、HH3、HH4和HH5)基因检测技术规程(山东省).pdf
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1、ICS 65.020.01 B 40 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 35602019 荷斯坦牛致死单倍型 (HH1、 HH3、 HH4 和 HH5)基因检测技术规程 Code of practice for molecular detection of lethal haplotypes (HH1, HH3, HH4 and HH5) in Holstein 2019 - 05 - 29 发布 2019 - 06 - 29 实施 山东省市场监督管理局 发 布 DB37/T 35602019 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 .
2、 1 4 检测原理 . 2 4.1 荷斯坦牛致死单倍型 HH1、HH3 和 HH4 的检测 . 2 4.2 荷斯坦牛致死单倍型 HH5 的检测 . 2 5 主要试剂 . 2 6 主要仪器设备 . 2 7 检测方法 . 2 7.1 样本采集 . 2 7.2 DNA 提取 . 2 7.3 DNA 浓度和纯度检测 . 3 7.4 引物序列 . 3 7.5 PCR 扩增 . 3 7.6 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳检测 . 3 7.7 测序分析 . 3 8 结果判定 . 3 8.1 致死单倍型 HH1 测序结果判定与表述 . 3 8.2 致死单倍型 HH3 测序结果判定与表述 . 4 8.3 致死单倍型
3、 HH4 测序结果判定与表述 . 4 8.4 致死单倍型 HH5 扩增条带判定与表述 . 5 9 废弃物的处理 . 5 10 检测过程中防止交叉污染的措施 . 5 附 录 A (资料性附录) 主要试剂 . 6 附 录 B (资料性附录) 主要仪器设备 . 7 附 录 C (规范性附录) PCR 扩增产物 . 9 DB37/T 35602019 II 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位:山东省农业科学院奶牛研究中心、山东省畜牧总站、威海市畜牧兽医局、山东奥克斯畜牧种业有限
4、公司、江苏省农业科学院畜牧研究所。 本标准主要起草人:黄金明、鞠志花、王秀革、张思聪、赵国清、高亚平、魏晓超、姜强、刘文浩、张亚冉、李荣岭、李建斌、高运东、曲绪仙、侯明海、仲跻峰。 DB37/T 35602019 1 荷斯坦牛致死单倍型(HH1、HH3、HH4 和 HH5)基因检测技术规程 1 范围 本标准规定了荷斯坦牛四种致死单倍型(HH1、HH3、HH4和HH5)的检测方法和结果判定。 本标准适用于荷斯坦牛四种致死单倍型(HH1、HH3、HH4和HH5)的检测与诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件, 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注
5、日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.22004 转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T 276422011 牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法 NY/T 16722008 绵羊多胎主效基因FecB分子检测技术规程 NY/T 26952015 牛遗传缺陷基因检测技术规程 DB37/T 20372012 牛白细胞黏附缺陷症(BLAD)基因分子检测技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 荷斯坦致死单倍型1 Holstein lethal haplotype 1,HH1 由牛第5号染
6、色体的凋亡蛋白酶激活因子1(Apoptotic protease-activating factor 1,APAF1)基因产生的终止突变(g.63150400CT;rs448942533;牛参考基因组UMD 3.1)引起的一种隐性遗传缺陷。当突变等位基因纯合时,个体致死,大多数表现为妊娠早期流产,不易被观察,在健康奶牛群体中无纯合的HH1单倍型。 3.2 荷斯坦致死单倍型3 Holstein lethal haplotype 3,HH3 由牛第8号染色体的染色体结构维持2(Structural maintenance of chromosomes 2,SMC2)基因一个错义突变(g.95410
7、507TC;rs456206907;牛参考基因组UMD 3.1)引起的一种隐形遗传缺陷,与乳蛋白、繁殖年限、青年牛受胎率、母牛受胎率有关,当突变的等位基因纯合时致死。 3.3 荷斯坦致死单倍型4 Holstein lethal haplotype 4,HH4 DB37/T 35602019 2 由牛1号染色体的磷酸核糖甘氨酰胺转甲酰基酶 (Phosphoribosylglycinamide formyltransferase, GART)基因的一个错义突变(g.1277227AC;rs465495560;牛参考基因组UMD 3.1)引起的隐性遗传缺陷。HH4导致流产,与产奶、乳蛋白和繁殖力有关
8、,无纯合子个体。 3.4 荷斯坦致死单倍型5 Holstein lethal haplotype 5,HH5 由牛9号染色体的线粒体转录因子B1(Transcription factor B1, mitochondrial, TFB1M)基因缺失138.348 kb的区域(93232651 bp至93370998 bp;牛参考基因组UMD 3.1)造成的一种隐性遗传缺陷,携带者影响乳蛋白量和女儿妊娠率,无纯合子个体。 4 检测原理 4.1 荷斯坦牛致死单倍型 HH1、HH3 和 HH4 的检测 根据牛APAF1、 SMC2和GART基因的因果突变设计特异引物, 进行PCR扩增, 对扩增产物进行
9、测序分析,根据DNA测序的峰图及碱基序列比对结果,判断其基因型,确认是否携带致死单倍型。 4.2 荷斯坦牛致死单倍型 HH5 的检测 根据牛TFB1M基因的缺失序列,首先在牛TFB1M基因缺失序列中设计一对引物,进行PCR扩增,携带者与正常者均可扩增出目的条带。其次在牛TFB1M基因缺失序列两端设计一对引物,进行PCR扩增,携带者可扩增出目的条带,正常者因扩增片段太长,检测时无条带。最后根据两对引物的PCR扩增产物电泳条带,对致死单倍型HH5携带者和正常者综合进行判断。 5 主要试剂 除另有规定,所用试剂均为分析纯,水为符合GB/T 6682规定的双蒸水;高压灭菌条件为121 ,1.03410
10、5 Pa压力,蒸汽灭菌20 min。主要试剂见附录A。 6 主要仪器设备 见附录B。 7 检测方法 7.1 样本采集 颈静脉采集血样3 mL5 mL,ACD抗凝,-20 保存。对公牛,亦可采集23剂细管精液(0.25 mL或者0.5 mL规格),液氮保存。0.1 g0.3 g组织(耳组织、肌肉)或带毛囊的牛毛浸入75 %的酒精,-20 保存备用。 7.2 DNA 提取 7.2.1 血液 DNA 的提取 血液DNA提取按DB37/T 20372012中7.2.1规定的方法执行。 DB37/T 35602019 3 7.2.2 精液 DNA 提取 精液DNA提取按DB37/T 20372012中7
11、.2.2规定的方法执行。 7.2.3 组织和带毛囊的牛毛 DNA 提取 组织和带毛囊的牛毛DNA的提取按GB/T 276422011中附录B规定的方法执行。 7.3 DNA 浓度和纯度检测 按照 NY/T 16722008的规定执行。 7.4 引物序列 7.4.1 致死单倍型 HH1: APAF1 基因 上游引物 5 - ATTTGTTACCTAATGGTTGGC-3 ;下游引物 5 - TGCTACCTGAGAAATAATGAC-3 。扩增产物为 393 bp。 7.4.2 致死单倍型 HH3: SMC2 基因 上游引物 5 - TTTCTATAACTATCTTCCAGC-3;下游引物 5-
12、 ACAGTCTTGTTTTGATTGTGC-3。扩增产物为 596 bp。 7.4.3 致死单倍型 HH4: GART 基因 上游引物 5 - CCCATAGATGGCAGCCCACCAG-3 ;下游引物 5- GACCACAGTTACGGCAGCACAG-3。扩增产物为 646 bp。 7.4.4 致死单倍型 HH5: TFB1M 基因 引物 1,上游引物 1 5- GATATTCATTCTGTAAACACTCA-3;下游引物 1 5- CTTGCCCACGCTTTTACTCTA-3,扩增产物为 478 bp;引物 2,上游引物 2 5- CAAACATAAACTTACCTGAC-3;下游
13、引物 2 5- AATAAGTAGCAATCTGTCCT-3,扩增产物为 508 bp。 7.5 PCR 扩增 7.5.1 PCR 扩增体系 PCR mix 12.5 L、10 mol/L引物各1.0 L、模板DNA 50100 ng,加双蒸水至总体积25 L。 7.5.2 PCR 扩增循环参数 94 预变性5 min。94 变性30 s,52 61 退火30 s(HH1 52 ;HH3 50 ;HH4 61 ;HH5 引物1 52 /引物2 55 ),72 延伸30 s,35个循环。72 延伸7 min,4 保存。 7.6 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳检测 按NY/T 26952015中6.4
14、.2的规定执行。 7.7 测序分析 将致死单倍型HH1、HH3和HH4扩增的PCR产物直接进行测序分析。 8 结果判定 8.1 致死单倍型 HH1 测序结果判定与表述 8.1.1 PCR 扩增的 APAF1 基因片段测序结果见附录 C.1。 如图 1 所示, 将 PCR 产物测序结果利用 DNAstar软件进行比对,APAF1 基因 PCR 扩增产物的第 268 位碱基为 C 时,且测序峰图为单峰,表明是纯合基因型 CC,该个体表述为正常牛。 DB37/T 35602019 4 8.1.2 APAF1 基因 PCR 扩增产物的第 268 位碱基为 C 或 T 时,且测序峰图为套峰,表明是基因型
15、 CT,属于杂合子,该个体表述为致死单倍型 HH1 携带牛。 图1 牛 APAF1 基因 PCR 产物测序结果 8.2 致死单倍型 HH3 测序结果判定与表述 8.2.1 PCR 扩增的 SMC2 基因片段测序结果见附录 C.2。 如图 2 所示, 将 PCR 产物测序结果利用 DNAstar软件进行比对,SMC2 基因 PCR 扩增产物的第 264 位碱基为 C 时,且测序峰图为单峰,表明是纯合基因型 CC,该个体表述为正常牛。 8.2.2 SMC2 基因 PCR 扩增产物的第 264 位碱基为 C 或 T 时,且测序峰图为套峰,表明是基因型 TC,属于杂合子,该个体表述为致死单倍型 HH3
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