DB21∕T 2619-2016 传染性造血器官坏死病毒LAMP检测方法.pdf
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1、ICS 67.120.30 B 50 DB21 辽宁省地方标准 DB21/T 26192016 传染性造血器官坏死病毒 LAMP 检测方法 Loop-mediated isothermal amplification detection method for Infectious haematopoietic necrosis virus 2016 - 04 - 27 发布 2016 - 06 - 27 实施辽宁省质量技术监督局 发 布 DB21/T 26192016 1 前 言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。 本标准主要起草单位:
2、辽宁出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:肇慧君,胡强,张雪,刘钊,栾慎顺,李叶,胡传伟。 DB21/T 26192016 2 传染性造血器官坏死病毒 LAMP 检测方法 1 范围 本标准规定了传染性造血器官坏死病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus, IHNV) 病原分离和环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification ,LAMP)检测方法。 本标准适用于IHNV病原的流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件, 仅所注日期的版
3、本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18088 出入境动物检疫采样 SN/T 2123-2008出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范 3 符号代号和缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CPE:细胞病变(cytopathic effect) CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide) DEPC:焦炭酸乙二酯(diethypyrocarbonate) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraac
4、etic acid) HEPES:羟乙基呱嗪乙硫磺酸4-(2-Hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid RNA:核糖核酸(ribonucleic acid) LAMP:环介导恒温扩增(Loop-mediated isothermal amplification) Betaine:甜菜碱 Bst酶:Bst DNA聚合酶(大片段)Bst DNA polymerase(large fragment) AMV逆转录酶:AMV reverse transcriptase dNTP:脱氧核糖苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphos
5、phate) 4 试剂、仪器和耗材 4.1 试剂 4.1.1 引物 选取特异性的 IHNV 的糖蛋白基因(G 基因)的序列,设计出能专一性鉴别传染性造血器官坏死病毒的特异性引物组,该引物组由如下四条引物组成: 外引物1(F3):5-ATCGCGCTACCAGCTTCA-3 DB21/T 26192016 3 外引物2(B3):5-TCATTGTAGAGGGCCAGGAT-3 内引物1(FIP):5-GGTGGTGTTGTTTCCGTGCAATTTTTAATGGGAACGACCCTTTGG-3 内引物2(BIP):5-GTCGCCCAGTACAAGATGAGCATTTTCTTGGATGGGGTA
6、CGGATTT-3 4.1.2 Bst DNA polymerase:8U/L,-20保存,不要反复冻融或温度剧烈变化。 4.1.3 AMV 逆转录酶:15 U/L,-20保存,不要反复冻融或温度剧烈变化。 4.1.4 2reaction mixture:含 40mM Tris-HCL、20mM 氯化钾溶液、20mM 硫酸铵溶液、16mM 硫酸镁溶液、0.2%Tween-20、1.6M betaine(甜菜碱) 、2.8mM dNTPs。 4.1.5 Rnase inhibitor:40U/L。 4.1.6 显色液:浓度为 1000SYBR Green 。 4.1.7 阳性对照:IHNV 参考
7、株。 4.1.8 EPC 细胞系:用 M199 培养液 25培养。 4.1.9 FHM 细胞系:用 M199 培养液 25培养。 4.1.10 乙醇:分析纯,使用前预冷到-20。 4.1.11 氯仿:分析纯。 4.2 仪器与耗材 4.2.1 倒置显微镜。 4.2.2 恒温培养箱。 4.2.3 普通冰箱和超低温冰箱。 4.2.4 组织研磨器(研磨器处理参见附录 B) 。 4.2.5 高速台式离心机:7000g。 4.2.6 水浴锅或加热模块:65+1和 100+1。 4.2.7 移液器:量程 0.5L10L,量程 10L100L,量程 100L1000L。 4.2.8 96 孔细胞培养板。 4.
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