DB53∕T 914-2019 甘蔗线条花叶病毒外壳蛋白基因RT-PCR检测技术规程(云南省).pdf
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1、DB53/T 9142019 甘蔗线条花叶病毒外壳蛋白基因 RT-PCR 检测技术规程 2019 - 05 - 15 发布 2019 - 08 - 15 实施ICS 65.020 B 15 云南省地方标准 云南省市场监督管理局 发 布 DB53/T 9142019 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009标准化工作导则第1部分:标准的结构和编写给出的规则起草。 本标准由云南省农业科学院甘蔗研究所提出。 本标准由云南省农业标准化技术委员会(YNTC07)归口。 本标准起草单位:云南省农业科学院甘蔗研究所。 本标准主要起草人:单红丽、李文凤、黄应昆、王晓燕、张荣跃、李婕、仓晓燕、罗志明、尹炯
2、。DB53/T 9142019 1 甘蔗线条花叶病毒外壳蛋白基因 RT-PCR 检测技术规程 1 范围 本标准规定了甘蔗线条花叶病毒外壳蛋白基因的 RT-PCR 检测的仪器和用具、试剂、检测方法和结果判定等。 本标准适用于甘蔗线条花叶病毒的 RT-PCR 检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 甘蔗线条花叶病毒 甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus, SCSMV) 属于马铃薯 Y 病毒科(Potyviridae) 禾草病毒属 (Poacevirus),是引起甘蔗花叶病的主要病毒之一,详见附录 A。 2.2 外壳蛋白基因 外壳蛋白基因
3、(Coat protein genes, cp genes),是一种合成外壳蛋白的模板,通过转录、翻译合成外壳蛋白,同病毒的遗传物质构成完整病毒的 RNA 或 DNA 片段。 2.3 RT-PCR 反转录聚合酶链式反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)的简称,是一种在体外利用反转录酶将 RNA 反转录为 cDNA,再以 cDNA 为模板进行 PCR 反应,以实现扩增 RNA 上特异片段。 3 仪器和用具 3.1 主要仪器 电子天平,高速冷冻离心机,蛋白/核酸分析仪,PCR扩增仪,涡旋混匀器,微波炉,电泳仪,水平电泳槽,凝胶成像仪
4、,冰箱。 3.2 用具及耗材 DB53/T 9142019 2 可调微量移液器,研钵,移液器吸头,离心管,PCR 管。 4 试剂 4.1 常规试剂 液氮,焦碳酸二乙酯(DEPC)水,RNA 提取试剂,三氯甲烷,异丙醇,70%乙醇,无水乙醇。 4.2 RT-PCR 试剂 Oligo (dT) 18 引物(0.5 g/L),反转录酶(200 U/L),RNA酶抑制剂 (40 U/L), dNTP 混合物(10 mmol/L),含染料的Taq DNA 聚合酶混合物(5 U/L)。 4.3 引物 引物应符合以下要求: a) 引物序列,上游引物 SCSMV-F:5-ACAAGGAACGCAGCCACCT
5、-3,下游引物 SCSMV-R:5-ACTAAGCGGTCAGGCAAC-3; b) 目的扩增片段长度约 940 bp; c) 用灭菌 DEPC 水将上、下游引物分别配制成浓度为 20 g/L 的水溶液。 4.4 电泳缓冲液 按以下配制电泳缓冲液: a) 50 TAE 储存液:取 242 g Tris,先用 300 mL ddH2O 搅拌溶解后,加 100 mL 0.5 mol/L EDTA 的水; b) 用冰乙酸调 PH 至 8.0,用 ddH2O 定容至 1000 mL; c) 1TAE 工作液:用 ddH2O 将储存液稀释 50 倍。 4.5 扩增产物检测试剂 1.5 %(W/V)琼脂糖
6、,0.003%(V/V)Goldenview 核酸染料。 5 检测样 5.1 对照 5.1.1 阳性对照 以经过 RT-PCR 扩增和克隆测序分析为 SCSMV 的样品作为阳性对照。 5.1.2 阴性对照 以经过 RT-PCR 扩增和克隆测序分析为无 SCSMV 的样品作为阴性对照。 5.1.3 空白对照 以灭菌 DEPC 水作为空白对照。 DB53/T 9142019 3 5.2 取样 采集甘蔗叶片或芽作为待测样品,放入自封袋中,冷藏运输,到实验室液氮速冻后,于-80保存备用。 6 检测方法 6.1 总 RNA 提取 总 RNA 提取步骤如下: a) 取 0.1 g 待测样品置于研钵中,液氮
7、冷冻,研磨至粉状后放入 1.5 mL 离心管中; b) 用 RNA 提取试剂提取样品总 RNA,按提取试剂使用说明书进行操作; c) 提取后用蛋白/核酸分析仪检测 RNA 相对浓度,当 A260/A280 比值为 1.82.0 时,于 -80保存备用。 6.2 反转录 按以下步骤进行反转录: a) 以提取的总 RNA 为模板,在 PCR 管中按序依次加入:灭菌 DEPC 水 1.5 L、dNTP 混合物(10 mmol/L)5 .0 L、Oligo (dT) 18 引物(0.5 g/L)0.5 L、反转录酶(200 U/L)0.5 L、RNA酶抑制剂 (40 U/L) 0.5 L、RNA 模板
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