DB37∕T 4436-2021 禽白血病病毒与禽网状内皮组织增殖病病毒联合净化技术规程(山东省).pdf
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1、 ICS 11.220 CCS B 41 37 山东省地方标准 DB37/T 44362021 禽白血病病毒与禽网状内皮组织增殖病病毒联合净化技术规程 Technical regulations for elimination of avian leukosis virus and reticuloendotheliosis virus 2021-11-17 发布 2021-12-17 实施 山东省市场监督管理局 发 布 DB37/T 44362021 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专
2、利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位: 山东省动物疫病预防与控制中心、 山东农业大学、 山东益生种畜禽股份有限公司。 本文件主要起草人:胡莉萍、成子强、薛婧雯、周德方、陈静、江芳、张心悦。 DB37/T 44362021 1 禽白血病病毒与禽网状内皮组织增殖病病毒联合净化技术规程 1 范围 本文件规定了禽白血病病毒和禽网状内皮组织增殖病病毒的实验室检测技术要求和联合净化程序。实验室检测包括抗原的ELISA检测、RT-PCR检测和病毒分离鉴定。 本文件适用于原种鸡群、祖代鸡群和父母代种鸡群
3、的净化。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中, 注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 禽白血病病毒与禽网状内皮增殖病病毒实验室检测技术 4.1 器材 高温高压灭菌锅 (温度范围:105 134 ;额定压力:0.23 Mpa)、离心机(转速:2 000 rpm14 000 rpm)、PCR仪、二氧化碳恒温细胞培养箱、分光光度计、酶标仪、冰箱。 4.2 材料与试剂
4、 4.2.1 无 RNase 水。 4.2.2 商品化的 ALV 与 REVELISA 抗原检测试剂盒。ALV 和 REVELISA 抗原检测试剂盒均通过检测泄殖腔拭子,分别检测 ALV 所有亚群共有的抗原 p27 蛋白,或 REV 的主要免疫原性蛋白 p30,从而对 ALV 和REV 的感染情况进行判定。 4.2.3 商品化的 RNA 提取试剂盒。 4.2.4 商品化的 RNA 反转录试剂盒。 4.2.5 PBS 缓冲液:NaCl 8 g,KCl 0.2 g,Na2HPO4 1.42 g(Na2HPO412H2O 3.58 g),KH2P04 0.27 g溶于蒸馏水,定容为 1 000 mL
5、,过滤后高温高压灭菌备用。 4.2.6 细胞生长培养基:商品化的 DMEM 液,加 10 %胎牛血清,青霉素、链霉素各 250 IU/mL,储存于4 冰箱备用。 4.2.7 细胞维持培养基:配制方法同 4.2.6,使用胎牛血清浓度为 1 %。 4.2.8 ALV-A gp85、ALV-B gp85、ALV-J gp85 及 REV gp90 基因片段的特异性引物,具体引物序列见附录 A。 4.2.9 除特别规定外,在检测中使用的试剂均为分析纯,实验用水应符合 GB/T 6682 的要求。 DB37/T 44362021 2 4.3 样品 4.3.1 血液样品 : 母鸡翅下静脉抽取 1 mL 静
6、脉血, 制备血清; 公鸡抽取 1 mL 静脉血, 2 000 rpm 离心,制备血浆,储存于-20 冰箱备用。 4.3.2 泄殖腔棉拭子样品:用无菌棉签插入泄殖腔内,擦拭后将棉签放入装有 1 mL PBS 缓冲液的离心管内,1 2000 rpm 离心 2 min 后将上清等分为 2 份,将进行抗原检测的样品储存于-20 冰箱备用,将进行病毒分离及 RNA 提取的样品储存于-80 冰箱备用。 检测样品前, 棉拭子应反复冻融 2 次3 次, 4 ,1 2000 rpm 离心 2 min3 min,吸取上清。血清样品于室温融化,500 倍稀释,用于检测。 4.3.3 蛋清样品:将蛋壳灭菌后,用镊子将
7、种蛋钝端敲破,使用移液器从破壳处沿蛋壳内壁伸入蛋内约 1 cm,吸取 1 mL 蛋清,并储存于-20 冰箱备用。 4.4 病毒抗原的 ELISA 检测 4.4.1 操作方法:采用商品化的 ELISA 试剂盒检测泄殖腔棉拭子或蛋清。按照试剂盒提供的检测步骤操作。 4.4.2 结果判定:按试剂盒提供的算法判定。ALV-p27 和 REV-p30 抗原其中之一为阳性,淘汰来源雏鸡。如两者均可疑或其中之一为可疑,则需进行 RT-PCR 检测或病毒分离。 4.5 RT-PCR 检测 4.5.1 操作方法 4.5.1.1 RNA 及 cDNA 提取:将冻存于液氮罐内的棉拭子 PBS 溶液用商品化试剂盒提取
8、 RNA,用分光光度计测浓度后,用商品化试剂盒反转录成 cDNA。RNA 储存于-80 冰箱,cDNA 储存于-20 冰箱。 4.5.1.2 PCR 及电泳检测: 完成 RNA 提取和将 RNA 反转录成 cDNA 后, 以 cDNA 为模板, 利用 ALV-A gp85、ALV-B gp85、ALV-J gp85 及 REV gp90 基因片段的特异性引物分别进行 PCR 扩增。扩增产物于 120 V,120 mA,使用 1 %琼脂糖凝胶进行电泳检测。剩余的 RNA 保存于-80 冰箱,cDNA 保存于-20 冰箱。 4.5.2 结果判定 琼脂糖凝胶电泳中出现ALV-A特异的1020bp片段
9、、ALV-B特异的1038bp片段、ALV-J特异的545 bp片段或REV特异的292 bp的片段时,可判定病毒检测阳性。具体反应体系及条件参见附录B。 4.6 病毒分离 4.6.1 操作方法 4.6.1.1 DF-1 细胞传代培养:取生长状态良好的 DF-1 细胞传代并用细胞生长培养基培养至少 8 h,待细胞密度达到 60 %70 %后用于病毒分离。 4.6.1.2 病毒液感作 DF-1 细胞: 在二氧化碳培养箱培养了至少 8 h 的 DF-1 细胞弃去细胞生长培养基,将 1 mL 棉拭子样品 PBS 液或 1 mL 血清/血浆注入培养瓶/培养板/培养皿内,作用于 DF-1 细胞,将细胞放
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