SN∕T 3433-2012 橡胶白根病菌检疫鉴定方法.pdf
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1、书书书?中华人民共和国出入境检验检疫行业标准? ? ? ? ? ? ? ?橡胶白根病菌检疫鉴定方法? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?发布? ? ? ? ? ? ? ? ? ?实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行?业?标?准橡胶白根病菌检疫鉴定方法? ? ? ? ? ? ? ?中 国 标 准 出 版 社 出 版北京市朝阳区和平里西街
2、甲?号? ? ? ? ? ?北京市西城区三里河北街? ?号? ? ? ? ? ?总编室? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?网址? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷?开本? ? ? ? ? ? ? ?印张?字数? ?千字? ? ? ?年?月第一版? ? ? ?年?月第一次印刷印数? ? ?书号? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?定价 ? ? ? ? 元书书书? ? ? ? ? ? ? ?参?考?文?献?张运强? 余卓桐? 周世强? 等?橡胶树白根病病原菌的鉴定?热带作物学报? ? ? ? ? ? ? ? ? ?魏铭丽? 崔昌华? 郑肖兰? 等?
3、 橡胶树白根病研究概述? 广西热带农业? ? ? ? ? ? ? ?张开明? 橡胶树白根病? 热带农业科技报? ? ? ? ? ? ? ? ? ?张欣? 陈勇? 谢艺贤? 等? 橡胶白根病鉴别与防治? 植物检疫? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
4、 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
5、 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
6、 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
7、 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
8、 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?书号? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?定价? ? ? ?元书书书前?言?本标准按照? ? ? ? ? ?给出的规则起草?请注意本文件的某些内容可能涉及专利?本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任?本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口?本标准负责起草单位? 中华人民共和国海南出入境检验检疫局?本标准参加起草单位? 中华
9、人民共和国宁波出入境检验检疫局? 中华人民共和国广东出入境检验检疫局?本标准主要起草人? 韩玉春? 刘福秀? 李伟东? 徐卫? 林明光? 赵立荣? 闻伟刚? ? ? ? ? ? ? ?橡胶白根病菌检疫鉴定方法?范围本标准规定了出入境植物检疫中橡胶白根病菌? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 的检疫鉴定方法?本标准适用于橡胶属? ? ? ? ?等植物种苗及其他繁殖材料上橡胶白根病菌的检疫鉴定?原理学名? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
10、?异名? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?橡胶白根病菌? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 属于真菌界? ? ? ? ? 担子菌门? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?担子菌纲? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 无隔担子菌亚纲? ?
11、 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 非褶菌目? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 薄孔菌科 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 硬孔菌属? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?真菌?橡胶白根病菌属根部专性寄居菌? 主要寄生橡胶属植物的根部? 离开寄主组织在土壤中不能存活?该病菌在侵染植物的过程中能产生粗细不一的根状菌索? 天气潮湿时在病变根部长出子实体?该病菌主要通过根系接触? 借根状菌索蔓延而传播? 也能借子实体产生的担孢子经过气传沉降到树桩切面或根系伤口形成新的侵染源? 再经过根系接触传播?该病菌的为害症状? 形态特
12、征? 培养性状? 致病性测定及分子生物学信息是鉴定橡胶白根病菌的依据?详细资料参见附录?和附录?试剂与培养基? ?试剂燕麦片? 琼脂粉? 蔗糖?三烃甲基氨基甲烷盐酸盐? 十六烷基三甲基溴化铵? 聚乙烯吡咯烷酮? 乙二胺四乙酸? 蛋白酶 ?冰醋酸? 溴酚蓝? 氯化钠? 三氯甲烷? 异戊醇? 异丙醇? ? 相对分子质量 ? ? ? ? ? ? 溴化乙锭? 次氯酸钠? ? ? ?缓冲液? 氯化镁? ? ? ? ? ?聚合酶? ? ?引物? 琼脂糖? ?培养基病菌分离和纯化采用燕麦琼脂培养基? 见附录? ?燕麦琼脂平板? 将灭菌燕麦琼脂培养基熔化后倒入灭菌的培养皿中? 形成? 厚的平板?燕麦琼脂斜面?
13、 将?燕麦琼脂培养基装入试管中? 灭菌后? 立即将试管摆放在一定斜度的坡面上? 凝固后制成斜面培养基?仪器和用具? ?仪器? ? ?仪? 超净工作台? 高压灭菌锅? 制冰机? 核酸蛋白分析仪? 高速冷冻离心机? 台式小型离心机? 超? ? ? ? ? ? ? ?低温冰箱? 常规冰箱? 漩涡振荡器? 电泳仪? 凝胶成像系统? 生物显微镜? 生物培养箱? 高压灭菌锅? 电子天平等? ?用具酒精灯? 三角瓶? 培养皿? 试管? 载玻片? 盖玻片? 接种针? 接种环? 移液器? 手术刀? 剪刀? 镊子? 玻璃棒等?检疫与鉴定? ?症状观察仔细观察橡胶树种苗根部? 看有无典型或可疑症状? 症状描述参见附
14、录 ? ?样品抽取发现可疑植株? 切取感病部位组织? 或将整株可疑植株带回实验室作进一步检测?鉴定方法? ?病菌形态鉴定? ? ?组织保湿观察用塑料盒作为培养器皿? 在盒内铺上保湿滤纸? 将采集可疑病根组织样品置于滤纸上? 无菌水喷雾保持病根组织高度湿润? 置培养箱内在? ?黑暗或弱光下培养?后观察病根有无菌索产生?若有菌索产生? 则进一步采用培养基法进行病菌分离纯化培养? ? ?病菌分离培养剪取可疑的病变植物组织? 先用清水洗干净? 用? ? ? ?次氯酸钠溶液表面消毒? ? ? 灭菌水洗?次? 无菌滤纸吸干表面水分? 将病组织移到燕麦琼脂平板培养基中? 置室温? ?培养?如发现可疑的菌落?
15、 及时将菌落移植另一新的燕麦琼脂平板上? 进一步纯化培养? 将纯化菌株移植到燕麦琼脂斜面培养基上?保存备用? ? ?病菌形态观测将? ? ?或? ? ?分离纯化的病菌在显微镜下进行镜检? 观察形态和测量数值? ?分子生物学鉴定? ? ? ? ?提取将有疑似症状的植物组织或分离的菌丝? 按? ? ?法提取 ? ? 见附录 ? ? ? ?特异性引物? ? ?凝胶电泳检测从植物病组织中抽提总 ? ? 用橡胶白根病菌的标准菌株作阳性对照? 用健康植株抽提总核酸作阴性对照? 用超纯水作为空白对照? 进行特异性引物? ? ?凝胶电泳检测? 见附录? ? ? ? ? ? ? ? ? ?致病性测定? ? ?供
16、试植物材料致病性测定采用栽培较为广泛分布的感病品种巴西橡胶? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?种子先用自来水冲洗干净? 并用? ? ? ?次氯酸钠表面消毒? ? ? 无菌水冲洗? ? ? 将处理好的种子放在人工气候箱? ?进行催芽?取萌芽种子播在? ? ? ? ? ?的塑料盆中? 种植介质为灭菌的细沙和有机土? 比例为? ? ? ?植株在室温下生长至平均株高? ? ? 约? ? ?个月? 时用于接种实验? ? ?菌丝块接种接种前? ? 将保存于?下的菌种移植转到新鲜燕麦琼脂平板上? 在? ?下? ?光照?黑暗重新培养?后在菌落边缘切取直径约? 的圆块? 作为接种菌
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