NY∕T 3280.2-2018 病毒微生物农药 棉铃虫核型多角体病毒 第2部分:棉铃虫核型多角体病毒水分散粒剂(农业).pdf
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1、ICS 65.100 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3280.2一2018病毒微生物农药棉铃虫核型多角体病毒第2部分:棉铃虫核型多角体病毒水分散粒剂Virus-basedinsecticides-Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus (HearNPV)-Part 2: H elicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus water dispersible granule ( W G ) 2018-07 -27发布2018 -12 -01实施中华人民共和国农业农村部发布目。自NYj T 3280
2、(病毒微生物农药棉铃虫核型多角体病毒分为3个部分:一一第1部分:棉铃虫核型多角体病毒母药;一一第2部分:棉铃虫核型多角体病毒水分散粒剂;一一第3部分:棉铃虫核型多角体病毒悬浮剂。本部分为NYjT3280的第2部分。本部分按照GBjT1. 1一2009给出的规则起草。本部分由农业农村部种植业管理司提出并归口。NY/T 3280.2-2018 本部分起草单位:农业农村部农药检定所、武汉中科威睿农业科技有限公司、中国科学院武汉病毒研究所。本部分主要起草人:肖凤平、王晓军、孙修炼、郭明程、类承凤、张忠信、张楠。I NY / T 3280. 2-2018 病毒微生物农药棉铃虫核型多角体病毒第2部分:棉铃
3、虫核型多角体病毒水分散粒剂范围本部分规定了棉铃虫核型多角标签、包装、储运、安全和保质期。本部分适用于工而成的棉铃虫核型多角2 下列文件。凡是不注日期的GB/ T 1601 GB/ T 1604 GB/ T 1605 GB 3796 GB/ T 4789 GB/ T 5451 GB/ T 6682 GB/ T 8170 GB/ T 14825 GB/ T 161 GB/ T 20813 GB/ T 28137 GB/ T 32775 3 术语和定义下列术语和定义适用3. 1 棉铃虫核型多角体病毒水dispersible granule (WG ) 以棉铃虫核型多角体病毒包涵体与适宜的载体及分散剂
4、经合适的工艺制作的可以在水中分散的粒剂。3.2 病毒包涵体polyhedral inclusion body( Pffi) 病毒水平传播的主要载体形式,其结构特征是病毒粒子包埋于蛋白质基质的多角体中。3.3 生测效价比potency ratio 根据药物的药理和对生物体的作用设计试验,比较样品、标准品引起的生物反应,测定药物效价或其生物学活性。1 NY/T 3280.2-2018 3. 4 菌落形成单位colony forming units(CFU) 由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落。指在琼脂平板上经过一定温度和时间培养后形成的每一个菌落,是计算细菌或霉菌数目
5、的单位。3.5 杂菌菌落总数number of microbial contaminants 将棉铃虫核型多角体病毒水分散粒剂样品稀释后涂布在琼脂营养培养基上,所得到的微生物(真菌和细菌)菌落数之和。4 要求4. 1 外观应为干燥的、能自由流动的灰褐色颗粒状,无可见机械杂质。4. 2 规范项目及指标棉铃虫核型多角体病毒水分散粒剂还应符合表l的要求。表1棉铃虫核型多角体病毒水分散粒荆控制项目指标项目指标病毒包涵体数量,Pffi/g二z标不值生测效价比(标准品LCso/待测样品LCso ),%二三80杂菌菌落总数,CFU/g王三1.0X107干燥减量,%5.0 细度(通过75m试验筛),%二?!9
6、 5.0pH 5. 07. 5 悬浮率(病毒包涵体),%二日5.0 粒径(0.25 mm1. 0 mm) ,% 二?!90.0 分散性,%二三7 5.0润湿时间,s 120 持久起泡量(1mi时,mL-主三25.05 试验方法5. 1 一般规定除非另有说明,本标准所用试剂均为分析纯,所述溶液均为水溶液,试验用水为GB/T6682中规定的三级水。数值修约规则与极限数值的表示和判定符合GB/T8170的规定。5. 2 抽样按GB/T1605中固体制剂采样方法进行。用随机数表法确定抽样的包装件,最终抽样量应不少于200 g。5. 3 病毒毒种的鉴定通过提取试样中病毒DNA作为模板,用HearNPVm
7、e53基因和dbp基因的特异性引物进行PCR扩增反应,琼脂糖凝胶电泳检测。当PCR扩增片段大小约为0.5kb时,回收扩增片段,并克隆到T载体上,用M13通用引物对克隆后的PCR产物进行测序,将测序结果分别与棉铃虫核型多角体病毒CG4株)的me53基因和dbp基因序列进行比对分析,试样与HearNPVCG4株)的me53基因及dbp基因的一致性均应大于98%,即认定试样中的病毒为棉铃虫核型多角体病毒。棉铃虫核型多角体病毒有效成分描述参见附录A。棉铃虫核型多角体病毒毒种的鉴定方法按照附录B的规定。5. 4 病毒包涵体含量的测定5.4. 1 方法提要NY/T 3280.2-2018 称取少量的病毒试
8、样,用定量的水稀释成水悬浮液,并稀释至适当倍数后,滴加在血球计数板上,在光学显微镜下计数。根据血球计数板上病毒包涵体的数量以及稀释倍数,计算出单位质量(体积)病毒的数量。5. 4. 2 仪器、设备分析天平:精确至0.0001g。微量移液器:0.1mLl mL。容量瓶:10mL。光学显微镜。血球计数板及专用盖玻片5. 4. 3 测定步骤5. 4. 3. 1 准确称取一稀释成适当浓度的悬球计数板的计数室自行缓缓渗入,矩形边缘为宜。5.4.3.2将载及正中央5个中5.4.4 计算试样中棉铃式中:Xj A B 4X106一一-180 一一计数小5.4.5 允许差病毒包涵体含量2次5. 5 生测效价比的
9、测定生测效价比(标准品LCso/5. 6 杂菌菌落数量的测定按GB/T4789.2的规定执行。5. 7 干燥减量的测定5.7. 1 仪器、设备分析天平:精确至0.001g。扁形称量瓶:直径40mm。电热干燥箱:控温范围(500C2000C),误差土20C。干燥器。5. 7. 2 试验步骤刻度,取此悬液洁干燥的血缘,让悬液片之间的. (1) 3 NY/T 3280.2-2018 将称量瓶在(105士2)OC电热恒温干燥箱内烘至恒重(精确至o.001 g)。称取试样10.0 g(精确至0. 001 g) ,置于预先恒重的称量瓶中,将此瓶放入(105士2)OC的电热恒温干燥箱内干燥,1h后取出,在干
10、燥器中冷却至室温,称重。5. 7. 3 测定结果干燥减量X2按式(2)计算。X2=气旦X100 . (2) 式中:Xz-一干燥减量,单位为百分率(%);m一一试样的质量,单位为克(g);mj一干燥后试样的质量,单位为克(g)。5. 8 细度的测定按GB/T16150-1995中湿筛法的规定执行。5.9 pH的测定按GB/T1601的规定执行。5. 10 悬浮率的测定称取1.00 g试样(精确至0.0001g),按GB/T14825的规定进行悬浮率测定。5. 11 粒度范围的测定5. 11. 1 仪器标准筛组:0.25rnm标准筛和1.0 rnm标准筛各1个。振筛机:振幅36rnm,263次/m
11、in。天平:精度为0.1 g。5. 11.2 测定步骤将标准筛上下叠装,大粒径筛置于小粒径筛上面,筛下装承接盘,同时将组装好的筛组固定在振筛机上,准确称取100g(精确至0.1g)样品,置于上面筛中,加盖密封,启动振筛机振荡10min,收集小粒径筛上物称量。5. 11. 3 计算试样的粒度X3按(3)式计算。式中:X3=些.!.X 100 (3) m X3一一试样的粒度,单位为百分率(%);m -一试样质量,单位为克(g); mj一小粒径筛上试样质量,单位为克(g)。5.11.4 允许误差2次平行测定结果之差,应不大于0.5%,取其算术平均值作为测定结果。5. 12 分散性试验按GB/T327
12、75的规定执行。5. 13 润湿时间按GB/T5451的规定执行。5. 14 持久起泡量的测定按GB/T28137的规定执行。4 NY/T 3280.2-2018 6 产品的检验与验收应符合GB/T1604的规定。极限数值处理采用GB/T8170中的修约值比较法。7 标志、标签、包装、储运、安全和保质期7. 1 标志、标签应符合GB3796中的有关规定。农药产品标签应符合GB/T20813的规定,注明低毒防曝晒防高温等标志。7. 2 包装应符合GB3796和GB20813中的有关规定。7. 3储运储运过程中应有遮避装置,严防日晒和潮湿。7.4 安全在使用说明书或包装容器上,除有相应的毒性标志外
13、,还应有毒性说明、中毒症状、解毒方法和急救措施。7. 5 保质期在规定储运条件下,棉铃虫核型多角体病毒水分散粒剂的质量保证期从生产日期算起为2年.2年保质期内,生测效价比和病毒包涵体数量不低于4.2中的指标。5 NY/T 3280.2-2018 A.1 中文通用名称棉铃虫核型多角体病毒。A.2 拉丁文学名Helicovera A. 4. 2 A. 4. 3包括低pH有A. 4. 4宿A.5 有效成分主要存棉铃虫核型多角体病毒A.6 生物活性杀虫。A.7 溶解性不溶于水,溶于弱碱。A.8 稳定性附录A(资料性附录)棉铃虫核型多角体病毒有效成分描述。本品低毒。噬消耗虫体组,形成流行性在40C以下可
14、以长期保存,加工过程中处理温度不得高于600C,在弱碱溶液、1000C以上高温条件下极快丧失生物活性。见光易丧失生物活性。NY/T 3280.2-2018 附录B(规范性附录)棉铃虫核型多角体病毒毒种的鉴定B. 1 方法提要通过提取试样病毒DNA作为模板,用棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV)me53基因和db基因的特异性引物进行PCR扩增反应,琼脂糖凝胶电泳反应检测后,回收扩增片段,克隆到T载体上,用M13通用引物对克隆后的PCR产物进行测序,将测序结果与HearNPV(G4株)的me53基因或dbp基因序列进行比对分析,确定试样的病毒是否为棉铃虫核型多角体病毒。B.2 试剂和溶液碱裂解液
15、:Na2C0331. 8 g,NaCl 29.25 g,Na2EDTA . 2H20 10. 09 g,溶于800mL蒸馆水,最后加蒸馆水定容至1L。乙二胶四乙酸(EDTA)。冰醋酸。十二皖基硫酸铀溶液(10%SD曰:100 g/ Lo 蛋白酶K(20mg/mL) :将200mg的蛋白酶K加入到9.5mL水中,轻轻摇动,直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到10mL,然后分装成小份储存于一20.C。10% SDS溶液:在90mL水中溶解10.0g SDS,加热至68.C助溶,加入几滴浓盐酸调节溶液的pH至7.2,加水定容至100mL,分装备用。Tris . HCl缓冲液(0.01mol
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