SN∕T 3391-2012 国境口岸巴贝西原虫检验规程.pdf
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1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 国境口岸巴贝西原虫检验规程犆 狅 犱 犲 狊狅 犳 犲 狓 犪 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犅 犪 犫 犲 狊 犻 犪犪 狋 犳 狉 狅 狀 狋 犻 犲 狉狆 狅 狉 狋 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准国境口岸巴贝西原虫检验规程 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京市朝阳区和平里西街甲号( )北京市西城区三里河北街 号( )总编室: ( ) 网址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号: 定价 元书书书前言本标准
2、按照 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位: 中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、 军事医学科学院微生物流行病研究所。本标准主要起草人: 付维明、 鞠文东、 孙毅、 杨德文、 徐宁、 包力、 程成、 王艳梅、 丁淑丽。犛 犖犜 国境口岸巴贝西原虫检验规程范围本标准规定了国境口岸巴贝西原虫检验对象、 方法、 结果报告、 生物安全要求及结果判定。本标准适用于国境口岸人、 蜱、 宿主动物感染巴贝西原虫的检验。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,
3、 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件, 其最新版本( 包括所有的修改单) 适用于本文件。 实验室生物安全通用要求 国境口岸森林脑炎监测规程术语和定义下列术语和定义适用于本文件。 巴贝西原虫犅 犪 犫 犲 狊 犻 犪狆 犪 狉 犪 狊 犻 狋 犲 狊是一种隶属巴贝西属、 寄生于血液红细胞中的原生动物, 可由蜱或输血传播, 引起人和动物巴贝西原虫病。实验室生物安全防护检测样本的采集和处理应符合无菌操作原则, 进行标本检测的实验室应符合 中生物安全二级实验室要求。对象 疑似感染巴贝西原虫的入出境人员、 口岸边境人群的血液样本和其他组织样本。 蜱及宿主动物标本。试剂及器材试剂及器材参见
4、附录 , 或购买符合要求的商品化试剂盒。标本的采集和处理参照附录的方法进行。犛 犖犜 实验室检验方法 形态学检验 将染色的玻片置于低倍显微镜载物台上, 对准焦距。在涂片上红细胞分散均匀的部分, 滴加镜油一滴, 在油镜下耐心仔细按顺序观察。 红细胞被染成红褐色, 巴贝西原虫细胞质被染成蓝色, 细胞核染成深蓝色, 但并非任何一个蓝点或蓝环即为巴贝西原虫, 因为可能有染液沉渣及其他异物混淆, 区别异物的主要依据是掌握显微镜的细调节器, 通过它的上下移动, 若蓝点或蓝环与红细胞在同一平面, 而且具有一定的轮廊结构是巴贝西原虫, 反之则为异物。 当确定为巴贝西原虫后, 进一步辨认它为红细胞内期的某个发育
5、阶段, 在薄血片中尚可找到其他白细胞或血小板。 对于几种常见白细胞的形态应加以区别,以免混淆: 环状体: 被寄生的红细胞尚无改变, 原虫形似宝石戒指。核呈深蓝色点状。细胞质为蓝色环状, 其大小不等, 约占红细胞的直径八分之一至四分之一左右。 二分体: 主要特征是细胞质有伪足伸展, 并形成空泡, 细胞核显著增大, 呈典型对称的配对排列。 四联体: 细胞质开始变为致密, 失去空泡及伪足, 呈规则的四联排列。 血清学检验参照附录规定的方法进行, 使用符合条件商品化试剂。 聚合酶链反应(犘 犆 犚) 检验参照附录 规定的方法进行。 离体培养鉴定按照附录规定的方法进行。结果判定 形态学检验 血涂片中观察
6、到典型的环形体或四联体, 报告“ 观察到巴贝西原虫” 。 血涂片中未观察到典型的环形体或四联体, 报告“ 未检出巴贝西原虫” 。 血清学检验 血清学检验阳性, 报告“ 巴贝西原虫抗体( 或抗原) 阳性” 。 血清学检验阴性, 报告“ 巴贝西原虫抗体( 或抗原) 阴性” 。 聚合酶链反应(犘 犆 犚) 检验 检验阳性, 报告“ 巴贝西原虫核酸检验阳性” 。 检验阴性, 报告“ 巴贝西原虫核酸检验阴性” 。犛 犖犜 离体培养鉴定 标本中培养出巴贝西原虫, 报告“ 细胞培养检出巴贝西原虫” 。 盲传三代未见可疑巴贝西原虫, 报告“ 细胞培养三代, 未检出巴贝西原虫” 。 阳性结果处置 离体培养阳性结
7、果应出具阳性报告单。 离体培养阳性结果应向上级主管部门报告。犛 犖犜 附录犃( 资料性附录)巴贝西原虫检验主要试剂及器材犃 主要试剂犃 姬姆萨(犌 犻 犿 狊 犪) 染液姬姆萨染料 甘油 甲醇 将 染料加到 甘油中, 混匀, 置 , 不时搅拌。取出凉至与室温相同时加入甲醇 , 用磁力搅拌过夜。用滤纸过滤, 滤液即为原液。应用时用 ( , ) 或蒸馏水稀释十倍。犃 培养基的主要成分及制备方法犃 犘 犚犕 犐 培养液() 溶液 高纯水或去离子水 () 缓冲液 高纯水或去离子水 注: ,犖 犖 为犖 羟乙基哌嗪 犖 乙磺酸, 相对分子质量 。() 将() 和() 分别溶解后混合在一起, 补充三蒸水至
8、 。混合后用 或更小孔径的微孔滤膜过滤除菌。分装 瓶,保存。犃 其他组分() 谷氨酰胺溶液 谷氨酰胺 高纯水 溶解后过滤除菌, 分装 瓶, 保存。()抗生素配制(万单位 )青霉素 链霉素 无菌高纯水 溶解后无菌操作分装 瓶, 保存。()两性霉素配制( )两性霉素 高纯水 犛 犖犜 过滤除菌, 分装瓶, 保存。犃 犚 犘犕 犐 完全培养基 培养液 谷氨酰胺( ) 抗生素( 青、 链霉素) 两性霉素( ) 灭活小牛血清 过滤除菌, 分装瓶, 保存。犃 阿氏(犃 犾 狊 犲 狏 犲 狉) 血液保存液葡萄糖 柠檬酸钠 柠檬酸 氯化钠 加蒸馏水至 , 溶解后过滤, 分装, 灭菌 , 保存。血液与阿氏液混
9、合比例为体积分数。犃 原虫冻存液( 水溶剂, 以下为体积分数)甘油 山梨醇氯化钠 犃 原虫复苏液( 水溶剂, 以下为体积分数)山梨醇 氯化钠 犃 犘 犆 犚试剂犃 ( ) : ( 三羟甲基氨基甲烷) , 浓盐酸( ) 调整 值。犃 缓冲液: ( ) , ( ) 。犃 缓冲液: 氯化钾( ) , 氯化镁( ) , , 。犃 电泳缓冲液: 碱, 冰乙酸, ( ) , 加蒸馏水至 , 使用时十倍稀释。犃 缓冲液: 在 蒸馏水中溶解 氯化钠( ) 和 柠檬酸钠, 加入数滴 氢氧化钠( ) 溶液调节 值至 , 加水定容至, 分装后高压灭菌。犃 琼脂糖: 电泳级。犃 器材犃 离体培养器材 孔细胞培养板;
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