SN∕T 3402-2012 两系水稻品种真实性与纯度鉴定 DNA分析法(出入境检验检疫).pdf
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1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准? ? ? ? ? ? ? ?两系水稻品种真实性与纯度鉴定? ? ?分析法? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?发布? ? ? ? ? ? ? ? ? ?实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书?中华人民共和国出入境检验检疫行?业?标?准两系水稻品种真实性与纯度鉴定? ?
2、 ?分析法? ? ? ? ? ? ? ?中 国 标 准 出 版 社 出 版北京市朝阳区和平里西街甲?号? ? ? ? ? ?北京市西城区三里河北街? ?号? ? ? ? ? ?总编室? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?网址? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷?开本? ? ? ? ? ? ? ?印张? ? ?字数? ?千字? ? ? ?年?月第一版? ? ? ?年?月第一次印刷印数? ? ?书号? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?定价 ? ? ? ? 元书书书前?言?本标准按照? ? ? ? ? ?给出的规则起草?本标准由国家认证认可监督管理委
3、员会提出并归口?本标准起草单位? 中华人民共和国安徽出入境检验检疫局? 安徽省农业科学院水稻研究所? 中华人民共和国湖南出入境检验检疫局?本标准主要起草人? 杨剑波? 姚剑? 陆徐忠? 倪金龙? 陈雪娇? 郑海松? 李云飞? 张萍? 张健? 从夕汉?刘海珍? 张小娟? 马琳? 朱金国? ? ? ? ? ? ? ?两系水稻品种真实性与纯度鉴定? ? ?分析法?范围本标准规定了水稻光? 温敏核不育系及两系杂交水稻品种真实性和纯度的? ? ?标记分析方法?本标准适用于水稻光? 温敏核不育系及两系杂交水稻品种真实性和纯度鉴定?规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的?凡是注日期的引用文件?
4、仅注日期的版本适用于本文件?凡是不注日期的引用文件? 其最新版本? 包括所有的修改单? 适用于本文件? ? ? ? ? ?农作物种子检验规程?扦样?术语和定义下列术语和定义适用于本文件? ?水稻光? 温敏核不育系? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?又称两系不育系? 利用水稻的光? 温敏核不育特性选育的水稻雄性不育系? 其在短日低温条件下表现为雄性可育? 可以繁殖种子? 在长日高温条件下表现为雄性不育? 可以用于制种? ?两系杂交水稻? ? ?
5、 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?利用水稻光? 温敏核不育系与恢复系杂交产生的? ?代? ?两系水稻? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?本标准中将两系杂交水稻和两系不育系统称为两系水稻? ?微卫星标记? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?由几个核苷酸? 一般为?个? 为重复单元的多达几十至几百次的串联重复? 由于基本单元重复次数的不同? 进而形成? ? ?座位的多态性? 根据? ? ?座位两侧保守的单拷贝序列设计一对特异引物来扩增? ? ?序列? 即可揭示其多态性? ?标准样品? ? ?
6、 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?经权威机构认定认证的代表已知品种特征特性的样品? 对有性繁殖物种而言? 一般为种子?原理我国生产上两系水稻的不育基因主要为光敏核不育基因? ? ?以及温敏核不育基因? ? ?其对应的特征性分子标记为? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 根据这些特征性标记可判断是否为两系水稻? 同时利用水稻基因组中大量存在的? ? ? 单元在不同品种间重复次数的差异? 通过 ? ? ? 多态性分? ? ? ? ? ? ? ?析? 区别不同水稻品种? 组合? ? 根据? ? ?标记具有共显性的特点和? ?杂交种子具有双亲等位标记互补
7、带型的特性? 可判断受检种子是否为杂交种?将光? 温敏核不育基因的特征性鉴定与? ? ?分析相结合?构成了本标准所指的两系水稻品种真实性和纯度鉴定的 ? ? 分析方法?仪器? ? ? ?扩增仪? ?高速冷冻离心机? 最大离心力? ? ? ? ?电泳检测系统? 垂直电泳系统? 水平电泳系统? ?微量移液器? 规格分别为? ? ? ? ? ? ? ? 连续可调? ?低温冰箱? 最低温度? ? ?凝胶成像系统? ?高压灭菌锅? ? ? ?电子天平? 精确度? ? ? ? ?恒温水浴锅? 温控精确度? ? ?脱色摇床? ? ?磁力搅拌器? ? ?微波炉? ? ?胶片观察灯? ? ?酸度计? 精度? ?
8、 ? ?试剂和溶液? ?试剂? ? ?十六烷基三乙基溴化铵? ? ? ? ? ?三羟甲基氨基甲烷碱? ? ? ? ? ? ? ? ? ?乙二胺四乙酸二钠? ? ? ? ? ? ? ? ? ?浓盐酸? ? ?氢氧化钠? ? ?氯化钠? ? ?三氯甲烷? ? ?异戊醇? ? ?异丙醇? ? ? ?无水乙醇? ? ? ?液氮? ? ? ? ? ? ?聚合酶及其配套缓冲液? ? ? ?四种脱氧核苷酸? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 缩略为? ? ? ? ? ? ?限制性内切酶? ? ?及其配套缓冲液? ? ? ?硼酸? ? ? ?去离子甲酰胺? ? ? ?琼脂糖? ? ? ?溴酚蓝?
9、 ? ? ?二甲苯氰? ? ? ? ?丙烯酰胺? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?甲叉双丙烯酰胺? ? ? ?尿素? ? ? ? ? ?四甲基乙二胺? ? ? ? ? ? ?过硫酸铵? ? ? ?冰醋酸? ? ? ?硫代硫酸钠? ? ? ?硝酸银? ? ? ?甲醛溶液? ? ? ? ?光温敏核不育基因特征性标记引物? ? ?标记引物? 引物序列见附录 ? 和? ? ?溶液详见附录?实验步骤? ?扦样受检样品的扦样? 分样和保存按 ? ? ? ? ? ?的规定执行? ?样品制备? ? ?检测样品为受检材料的组织或器官? 如? 种子? 幼苗? 植株幼嫩叶片等? ? ? ?从受检样品中随机抽取
10、?粒种子? 或?个单株? 分别提取基因组? ? 用于两系水稻真实性鉴定? ? ?从受检样品中随机抽取至少? ? ?粒种子? 或? ? ?个单株? 分别提取基因组? ? 用于品种纯度鉴定? ? ?两系水稻品种真实性和纯度鉴定时应以受检样品所标注品种的标准样品作为标准对照? 两系杂交水稻品种纯度鉴定时尽量以其双亲的标准样品作为标准对照? ?样品? ? ?提取将种子剥去颖壳? 碾压破碎后移入? ?离心管中? 向离心管中加入? ? ? ? ?预热的? ?提取液? ?孵育? 每隔? ? ? ?颠倒混匀一次? 加入等体积三氯甲烷?异戊醇混合液? 轻缓混匀? 室温静置? ? ? ? ? ? ?离心? ? ?
11、 ? 吸取上清液至另一支? ?离心管中? 再加入等体积异丙醇混匀?置于? ? ? ? ? ? ? ?离心? ? ? ? 弃上清液? 加入? ? ? ?乙醇洗涤沉淀? ? ? ?离心? ? ? ?后弃去乙醇? 室温干燥后加入? ?灭菌水? 充分溶解后备用?对于水稻幼苗或植株? 单株取叶片约? ? ? ? 置于? ?离心管中? 加液氮用玻棒充分研磨至粉末状? ? 提取过程同上?除上述方法外? 样品? ?的提取也可使用商业化的? ?提取试剂盒? ?两系水稻真实性和纯度鉴定? ? ?两系水稻鉴定用附录 ? 中引物对样品 ? ? 进行扩增? ? ?扩增反应体系参见表 ? ? 推荐反应程序为? ? ? ?
12、 ? ? ? ? ? ? ? ? ?循环? ?次? ? ? ? ? ?保存?其中? ? ? ? ? ? ?标记的扩增产物需经限制性内切酶? ? ?酶切反应后? 再进行琼脂糖凝胶电泳检测?酶切反应体系参见表 ? ? 推荐反应程序为? ?孵育? ? ?产物或酶切产物采用琼脂糖凝胶? 参见附录? 电泳进行? ? ? ? ? ? ? ?检测? ? ?两系水稻品种真实性鉴定从附录?中先选择? ?个? ? ?位点? 每条染色体上任意选?个? 对受检样品和标准对照样品 ? ?进行分析? ? ?扩增反应体系参见表 ? ? 推荐反应程序为? ? ? ? ? ? ? ? ? ?循环? ?次? ? ? ? ?保存?
13、 采用变性聚丙烯酰胺凝胶? 参见附录? 电泳检测? ? ?两系杂交水稻品种纯度鉴定利用? ? ?标记? 见附录? 对受检样品的双亲? ?进行分析? ? ?扩增反应体系参见表 ? ? 推荐反应程序为? ? ? ? ? ? ? ? ? ?循环? ?次? ? ? ? ?保存?采用变性聚丙烯酰胺凝胶? 参见附录? 电泳检测?选择?对双亲互补型的? ? ?引物? 对各受检单株进行? ? ?位点分析?结果判定? ?两系水稻判定根据光? 温敏核不育基因特征性标记在受检样品中扩增产物或其酶切产物的电泳带型? 是否符合表? ?中的规定? 判断不育基因存在与否及其类型?若检测出? ?或? ?基因? 则判定为光敏型
14、两系水稻? 若检测出? ? ?基因? 则判定为温敏型两系水稻?只要任一不育基因存在? 即判定为两系水稻品种? ?两系水稻品种真实性判定? ? ?若? ?的判读结果为两系水稻? 则利用? ? ?核心标记进行品种的真实性鉴定? ? ?根据受检样品与标准对照电泳谱带的异同? 判定受检样品的真实性? ? ?若先选择的? ?个? ? ?位点中?差异位点数? 判读为不同品种?差异位点数? 继续用剩余的? ?对引物进行检测?若累计? ?个? ? ?位点中?差异位点数? 判读为不同品种?差异位点数? 判读为近似品种?差异位点数? 判读为相同或极近似品种? ?两系杂交水稻品种纯度判定根据受检单株是否具有父母本互
15、补带型? 判定其是否为真实杂交种?根据各受检单株的判读结果?按式? 计算受检样品的纯度? ? ?式中? ? ?品种纯度? ? ?供检种子粒数? 幼苗数? 株数? ? ? ?判定为异品种的种子粒数? 幼苗数? 株数? ?样品保存受检样品应至少保存?个月? 以备复验? ? ? ? ? ? ? ?附?录? 规范性附录?用于两系水稻鉴定的分子标记表? ?用于两系水稻鉴定的分子标记标记名称标记基因正向引物序列? ? ?反向引物序列? ? ? 值扩增产物大小? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
16、 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?注?用? ? ? ? ? ? ?标记检测? ?基因时? 不携带? ?基因的水稻会扩增出?个? ? ? ?的片段? 携带? ?基因的两系不育系会扩增出?个? ? ? ?的片段? 携带? ?基因的两系杂交水稻会扩增出? ? ? ?和? ? ? ?的?个片段?注?用
17、? ? ? ? ? ? ?标记检测? ?基因时? 在两系水稻和非两系水稻中均可扩增出?个? ? ? ?的片段?在不携带? ?基因的水稻中? 该标记扩增产物能够被限制性内切酶? ? ?酶切成? ? ? ?和? ? ? ?的?个片段?在携带? ?基因的两系不育系中? 该标记扩增产物不能被? ? ?酶切开? 携带? ?基因的两系杂交水稻的扩增产物经? ? ?酶切产生? ? ? ? ? ? ?和? ? ? ?的?个片段?注?用? ? ? ? ? ? ?标记检测? ? ?基因时? 不携带? ? ?基因的水稻会扩增出?个? ? ? ?的片段? 携带? ? ?基因的两系不育系会扩增出?个? ? ? ?的片段
18、? 携带? ? ?基因的两系杂交水稻会扩增出? ? ? ?和? ? ? ?的?个片段? ? ? ? ? ? ? ?附?录? 规范性附录?用于两系水稻品种真实性和纯度鉴定的? ? ?标记表? ?用干两系水稻品种真实性和纯度鉴定的? ? ?标记序号位点染色体正向引物序列? ? ?反向引物序列? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
19、? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
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