SN∕T 3504-2013 甲壳类水产品中并殖吸虫囊蚴检疫技术规范(出入境检验检疫).pdf
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1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 甲壳类水产品中并殖吸虫囊蚴检疫技术规范犙 狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲狆 狉 狅 狋 狅 犮 狅 犾 犳 狅 狉犿 犲 狋 犪 犮 犲 狉 犮 犪 狉 犻 犪狅 犳犘 犪 狉 犪 犵 狅 狀 犻 犿 狌 狊犻 狀犮 狉 狌 狊 狋 犪 犮 犲 犪 狀 狊 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准甲壳类水产品中并殖吸虫囊蚴检疫技术规范 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京市朝阳区和平里西街甲号( )北京市西城区三里河北街 号( )总编室: ( ) 网址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印
2、刷开本 印张 字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号: 定价 元书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位: 中华人民共和国上海出入境检验检疫局、 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、 广西大学。本标准主要起草人: 李树清、 陈韶红、 黄维义、 张永年、 陈志飞、 李雯雯、 王巧全、 张强、 王艳、 李健、常正山、 陈盈。犛 犖犜 甲壳类水产品中并殖吸虫囊蚴检疫技术规范范围本标准规定了并殖吸虫囊蚴的形态学鉴定和 检测方法。本标准适用于蟹、 虾等甲壳类水产品中并殖吸虫囊蚴的检疫、 流行病学调查和监测。规范性引用文件下列文件对于
3、本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件, 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件, 其最新版本( 包括所有的修改单) 适用于本文件。 分析实验室用水规格和试验方法 出入境动物检疫采样概述并殖吸虫俗称肺吸虫, 主要寄生于人、 犬、 猫、 鼠等哺乳动物的肺内。人因食入生的、 未煮熟的含有并殖吸虫囊蚴的蟹类、 蜊蛄和沼虾等水产品而感染。并殖吸虫的分类、 分布及生活史参见附录。设备和材料 仪器和器材 生物显微镜。 体视显微镜。 扩增仪。 电泳仪。 凝胶成像系统。 网筛( 目, 目) 玻璃珠( ) 。 试剂和溶液 犜 犪 狇酶() 。 。 。 缓冲液( 无 ) 。 分子量指示物: 。
4、 水( 符合 中一级水的规定) 。 人工消化液、 乙酸电泳缓冲液( ) 、 琼脂糖凝胶、加样缓冲液( 配制见附录) 。犛 犖犜 引物扩增并殖吸虫核糖体 第二内转录间隔区( ) 引物序列为:上游引物 : 下游引物 : 检验步骤 样品采集临床上采集的样品为溪蟹、 蜊蛄和沼虾等甲壳类水产品。采样比例按照 执行。 样品处理 捣碎法为保证囊蚴的完整性, 推荐使用竹筒和竹棒( 或其他类似替代品) 捣碎样品, 用生理盐水清洗, 用 目网筛过滤, 除去粗蟹壳。滤液再用 目网筛过滤, 滤液置于锥形量筒内, 加水至量简的最大刻度处, 沉淀洗涤至水清, 全部沉渣吸入玻璃平皿, 在体视显微镜下, 收集囊蚴, 用生物显
5、微镜按照 进行形态鉴定。 消化法样品量多时, 可使用消化法。将样品用竹筒和竹棒捣碎, 移入烧杯中, 按照样品与人工消化液的比例加入消化液, 于 消化至无可见的肉组织。消化后的悬液用 目网筛过滤, 除去粗蟹壳。滤液再用 目网筛过滤, 滤液置于锥形量筒内, 加水至量筒的最大刻度处, 沉淀洗涤全水清。全部沉渣吸入玻璃平皿, 在体视显微镜下, 收集囊蚴, 用生物显微镜按照 进行形态鉴定。 囊蚴保存鉴定后的部分囊蚴保存于 酒精中或于少量生理盐水中 速冻, 另取部分形态一致的囊蚴按 提取 。 并殖吸虫囊蚴形态鉴定并殖吸虫囊蚴一般呈球形或近球形, 通常具有层囊壁, 但因虫种不同, 可有层囊壁或仅层囊壁。后尾
6、蚴折叠卷曲在囊内, 能看见充满黑色颗粒的排泄囊和两侧弯曲的肠管。口吸盘有时可见到, 而腹吸盘则常被排泄囊所遮盖, 后尾蚴与囊壁间可有明显的空隙, 也可无空隙。不同种的并殖吸虫囊蚴大小有差异, 如卫氏并殖吸虫小囊蚴直径为 , 大囊蚴直径为 。斯氏并殖吸虫囊蚴, 直径为 左右。并殖吸虫囊蚴模式图及实物图参见附录。由于并殖吸虫种类多,囊蚴形态相似, 仅凭囊蚴形态很难准确鉴定并殖吸虫虫种。因此, 需要结合分子生物学方法进一步鉴定虫种。 并殖吸虫囊蚴分子生物学鉴定 样品犇 犖 犃提取 提取方法可选用等效商品化试剂盒, 下面以 )公司的抽提试剂盒)使用 公司的 试剂盒进行描述只是为了叙述方便, 并不代表推
7、荐 的产品, 标准的使用人可以使用其他公司的同类产品。犛 犖犜 ( ) 进行 提取。取主要形态特征一致的囊蚴个 个放入 离心管中, 加入 和少量玻璃珠振荡 , 再加入蛋白酶( , 活力单位 ) 与 缓冲液 , 消化。期间不时振荡, 至囊蚴充分裂解。 消化完全后, 涡旋振荡 , 加 缓冲液 , 立即涡旋振荡混匀, 再加入 乙醇( ) , 涡旋振荡混匀。 将离心柱置于收集管上, 将上一步的混合物吸入离心柱中, 离心 , 弃收集管。 将离心柱置于新的收集管中, 加 缓冲液 , 离心 , 弃收集管。 将离心柱置于新的收集管中, 加 缓冲液 , 离心 , 弃收集管。 将离心柱置于灭菌的 离心管中, 加入
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