WS 281-2008 狂犬病诊断标准(卫生).pdf
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1、ICS 11.020 c59 23222-2008 引TS中华人民共和国卫生行业标准ws 281-2008 狂犬病诊断标准Diagnostic criteria for rabies 2008-02-28发布2008-09-01实施叶1主只、民三主是奉日OOJ主当三音民发布ws 281-2008 目。吕根据中华人民共和国传染病防治法制定本标准。按照国家质检总局国家标准委公告(2005年第146号),GB17014-1997(狂犬病诊断标准及处理原则自本标准实施之日起废止。本标准的附录A是规范性附录,附录B、附录C、附录D是资料性附录。本标准由卫生部传染病标准专业委员会提出。本标准由中华人民共和
2、国卫生部批准。本标准起草单位:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所、山东省疾病预防控制中心、泸州医学院附属医院、武汉生物制品研究所、中国疾病预防控制中心疾病控制与应急处理办公室。本标准主要起草人:唐青、王显军、余光开、严家新、许真。ws 281-2008 狂犬病诊断标准1 范围本标准规定了狂犬病的诊断依据、诊断原则、诊断和鉴别诊断。本标准适用于全国各级医疗卫生机构及其工作人员对狂犬病的诊断、报告。2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2. 1 狂犬病街毒street virus 自然状态下从感染动物或患者中发现的狂犬病病毒。2.2 狂犬病实验室固定毒fixed virus 狂犬病街毒株经过
3、动物或细胞系列传代适应特定宿主后,其致病性减弱。3 诊断侬据3. 1 流行病学史有被犬、猫、野生食肉动物以及食虫和吸血蝙蝠等宿主动物咬伤、抓伤、舔献黠膜或未愈合伤口的感染史。3.2 临床表现3.2. 1 狂躁型狂躁型是我国最常见的类型。主要表现有:在愈合的伤口及其神经支配区有痒、痛、麻及蚁走等异常感觉,以后出现高度兴奋、恐水、怕风、阵发性咽肌瘟孪和交感神经兴奋症状如流涎、吐沫、多汗、心率加快、血压增高等。逐渐发生全身弛缓性瘫痪,最终因呼吸、循环衰竭而死亡。3.2.2 麻癖型麻痹型在我国较为少见。临床表现为:前驱期多为高热、头痛、呕吐及咬伤处疼痛等,无兴奋期和恐水症状,亦无咽喉瘟孪和吞咽因难等表
4、现。前驱期后即出现四肢无力、麻痹症状,麻痹多开始于肢体被咬处,然后呈放射状向四周蔓延。部分或全部肌肉瘫痪,咽喉肌、声带麻痹而失音,故称哑狂犬病。3. 3 实验室检查3.3. 1 直接荧光抗体法(dFA)(见A.1)或ELISA(见A.2)检测患者唾液、脑脊液或颈后带毛囊的皮肤组织标本中狂犬病毒抗原阳性,或用RT-PCRC见A.3) 检测狂犬病病毒核酸阳性。3.3.2 细胞培养方法(见A.4)从患者唾液、脑脊液等标本中分离到狂犬病病毒。3.3.3 脑组织检测尸检脑组织标本,用直接荧光抗体法CdFA)C见A.1)或ELISAC Jh!, A. 2)检测狂犬病病毒抗原阳性、RT-PCRC见A.3)检
5、测狂犬病病毒核酸阳性、细胞培养方法(见A.的分离到狂犬病病毒。4 诊断原则根据患者的流行病学史、临床表现和实验室检查结果进行综合判断,病例确诊需要实验室证据。狂犬病的病原学、流行病学和临床表现参见附录D,狂犬病特异性抗体检测参见附录B。1 ws 281-2008 5 诊断5. 1 临床诊断病例符合下列任一项即可诊断:5. 1. 1 符合3.2. 1者。5. 1.2 符合3.1加3.2. 2者。5.2 确诊病例临床诊断病例加3.3.1、3.3.2、3.3.3中的任何-项者。6 鉴别诊断本病尚需与狂犬病恐怖症、破伤风、病毒性脑膜脑炎、脊髓灰质炎等鉴别,参见附录C。2 ws 281-2008 附录A
6、(规范性附录)狂犬病特异性病原学检测A.1 直接荧光抗体方法(dFA)检测狂犬病病毒抗原、1皮肤组织和体液(唾A. 1. 3. 1 A. 1. 3. 2 室温斗,印片或切片上,A.2. 1 原理根据抗原抗体特异性结合特点,用抗狂犬病病毒特异性单克隆抗体包被塑料板,与标本中待检抗原结合,其中待检抗原又与后加入的辣根过氧化物酶标记抗狂犬病病毒单克隆抗体特异性结合,再通过辣根过氧化物酶与底物作用产生可见的颜色反应,最终达到检测目的。显色程度与待检抗原含量呈正相关。A. 2. 2 试验材料A. 2. 2. 1 用于检测的标本为狂犬病患者脑脊液或死亡后脑组织。A. 2. 2. 2 多株抗狂犬病病毒特异性
7、单克隆抗体混合包被的酶标板条。A. 2.2. 3 阳性病毒对照(冻干,已灭活)。3 ws 281-2008 A. 2. 2. 4 样品稀释液:pH7.4 PBS。A. 2.2. 5 辣根过氧化物酶标记的抗狂犬病病毒单克隆抗体。A.2. 2. 6 洗涤液:pH7.4PBS-T(PBS十0.05%吐温-20)。A. 2. 2. 7 底物液:OPD或TMB。A. 2. 2. 8 终止液:4NH2S04oA.2. 2. 9 酶标仪。A.2.3 检测步骤A. 2. 3.1 取待检脑组织加样品稀释液研磨制成10%脑组织悬液,或直接取待检脑脊液约0.5mL,用稀释液将待检脑悬液和阴性、阳性对照各1: 20稀
8、释(阴性对照自设,待检脑脊液不稀释),加人各自对应孔中,其中待测样品各1孔,阴性、日性对照各2孔,100L/孔。设2孔为空白对照,只加样品稀释液,100L/孔,将酶标可拆板置湿盒内,370C温育30min。剩余的阳性病毒对照保存于200C 备用。A.2. 3. 2 将浓缩的洗涤液用蒸馆水30倍稀释成工作浓度,取出酶标板,甩干,将洗涤液加满各孔,倾出,甩干,重复以上操作共3次。A. 2. 3. 3 取酶结合物加入各孔(空白对照孔中不加酶结合物),100L/孔或2滴,置湿盒内,3 7C温育30min。A.2.3.4 取出酶标板、倾出液体,甩干,同上法洗板6次。A.2. 3. 5 将显色液A/B各一
9、滴加入各孔中,置湿盒内至阳性对照显蓝色。将终止液加人各孔,50L/孔或1滴,终止反应。置酶标仪上读数。A. 2. 4 结果判断空白和阴性对照孔元色,而阳性对照孔显蓝色,则结果成立。以空白两孔的平均数调零,在酶标仪上测定450nm处各孔吸光(A)值,待测样品A值大于或等于阴性对照A平均值十0.08,即30D阴性对照十0.08,则表明该样品为狂犬病病毒抗原阳性。A.2.5 意义检测到狂犬病病毒抗原阳性有诊断意义。A.3 RT-PCR法检测狂犬病病毒核酸A. 3.1 原理PCR技术是依据双链DNA分子碱基配对原则,采用耐热DNA聚合酶和DNA合成引物,以目的基因为模板在体外特异性扩增DNA片断。狂犬
10、病病毒为负链RNA病毒,PCR前需要经过逆转录酶作用,合成第一条cDNA链(RT),再进行PCR扩增,即RT-PCR。基于这一原理,设计狂犬病病毒基因片断特异性扩增引物,对狂犬病患者的标本进行狂犬病病毒特异性核酸的扩增和检测,阳性结果可以判定为狂犬病病毒感染。A. 3. 2 试验材料A. 3. 2.1 可用于狂犬病患者诊断的标本:唾液、泪液、尿液、鼻咽洗液、后颈带毛囊的皮肤组织或脑脊液等;死亡后用于诊断的标本:脑组织。A. 3. 2. 2 PCR扩增引物:以特异性扩增狂犬病病毒核蛋白(NP)基因最保守区域为目的基因片断,设i十一对寻|物:N1(十):(587)5-TTT GAG ACT GCT
11、 CCT TTT G(605)-3 ;N2C一):(092)5-CC CAT AT A GCA TCC TAC0013)-3 0 A. 3.2. 3 细胞总RNA分离试剂:TRlzol(用于组织标本); TRlzol SL(用于液体标本)。A. 3. 2. 4 AMV逆转录酶、DNA聚合酶、dNTPMixture等。A. 3. 3 检测步骤A. 3. 3.1 病毒RNA的提取:待检标本用细胞总RNA分离试剂提取病毒RNA,按照细胞总RNA分4 ws 281-2008 离试剂说明提取,制备模板RNA。A. 3. 3. 2 逆转录合成cDNA:根据AMV逆转录酶反应要求,按照说明书通过逆转录反应合
12、成与目的基因RNA序列互补的cDNA。A. 3. 3. 3 PCR扩增:PCR循环特异性扩增目的基因cDNA,反应条件:950C预变性5min;940C 45s、500C50s、720C60s,共扩增30个35个循环;最后720C延伸10min。A. 3. 3. 4 用1%2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。A. 3. 4 结果判断如果电泳条带的分子量与预期片段大小相同,表明为狂犬病病毒N基因特异性扩增区段阳性。A. 3. 5 意义阳性结果表明有狂犬病病毒感染,有确诊意义。A.4 细胞培养方法分离狂犬病病毒A.4.1 原理狂犬病病毒感染动物,经过在中枢神经系统繁殖后,病毒可以随神经纤维离心性
13、散播到身体其他部位的绝大多数器官,因此狂犬病病毒适应的宿主细胞较为广泛。通过观察狂犬病病毒感染细胞后所产生的细胞病理改变,结合特异敏感的检测技术检测出病毒的存在,证明为狂犬病病毒感染。A.4.2 试验材料A. 4. 2. 1 可用于狂犬病病毒分离的标本患者的唾液、脑脊液或皮肤组织等;死亡后用于病毒分离的标本:脑组织。A. 4. 2. 2 细胞系鼠神经瘤细胞、BHK细胞、Vero细胞等。A. 4.2.3 细胞培养基成分Eagles培养液、谷氨眈胶、青霉素/链霉素、胎牛或小牛血清、7.5%碳酸氢锅。A. 4. 2. 4 BHK或Vero细胞培养基a)生长液:100mL Eagles生长液中包含Ea
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