HJ 347.2-2018 水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法(环境保护).pdf
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1、中华人民共和国国家环境保护标准 HJ 347.22018 部分代替 HJ/T 3472007 水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法 Water qualityDetermination of fecal coliformManifold zymotechnics 2018-12-26 发布 2019-06-01 实施 生 态 环 境 部 发 布 HJ 347.22018 i 中华人民共和国生态环境部 公 告 2018 年 第 73 号 为贯彻中华人民共和国环境保护法 ,保护生态环境,保障人体健康,规范生态环境监测工作,现批准水质 粪大肠菌群的测定 滤膜法等五项标准为国家环境保护标准,并予发布。
2、标准名称、编号如下。 一、 水质 粪大肠菌群的测定 滤膜法 (HJ 347.12018) ; 二、 水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法 (HJ 347.22018) ; 三、 水质 细菌总数的测定 平皿计数法 (HJ 10002018) ; 四、 水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法 (HJ 10012018) ; 五、 水质 丁基黄原酸的测定 液相色谱- 三重四极杆串联质谱法 (HJ 10022018) 。 以上标准自 2019 年 6 月 1 日起实施,由中国环境出版集团出版,标准内容可在生态环境部网站( 自以上标准实施之日起, 水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法和滤
3、膜法(试行) (HJ/T 3472007)废止。 特此公告。 生态环境部 2018 年 12 月 26 日 HJ 347.22018 iii 目 次 前 言. iv 1 适用范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 方法原理.1 5 干扰和消除.1 6 试剂和材料.2 7 仪器和设备.2 8 样品.3 9 分析步骤.3 10 结果计算与表示.5 11 精密度和准确度.5 12 质量保证和质量控制.6 13 废物处理.6 附录 A(资料性附录) 最大可能数(MPN)表 .7 附录 B(资料性附录) 粪大肠菌群检验记录及报告推荐格式 .11 HJ 347.22018 iv 前 言
4、为贯彻中华人民共和国环境保护法和中华人民共和国水污染防治法 ,保护生态环境,保障人体健康,规范水中粪大肠菌群的测定方法,制定本标准。 本标准规定了测定地表水、地下水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的多管发酵法。 本标准是对水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法和滤膜法(试行) (HJ/T 3472007)多管发酵法部分的修订。 本标准首次发布于 2007 年,原起草单位为中国环境监测总站。本次为第一次修订。 本次修订的主要内容如下: 完善了方法原理的表述; 增加了 12 管法和 15 管法的检出限; 分析步骤中增加了 12 管法,完善了样品稀释方法; 增加了规范性引用文件、术语和定义、干扰和消除、
5、仪器和设备、样品采集、样品保存、精密度和准确度、质量保证和质量控制、废物处理等章节; 将 MPN 表移至附录中。 自本标准实施之日起,水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法和滤膜法 (试行) (HJ/T 3472007)废止。 本标准的附录 A 和附录 B 为资料性附录。 本标准由生态环境部生态环境监测司、法规与标准司组织制订。 本标准起草单位:辽宁省环境监测实验中心。 本标准验证单位:大连市环境监测中心、丹东市环境监测中心站、锦州市环境监测中心站、辽阳市环境监测站、沈阳市疾病预防控制中心和辽宁北方环境检测技术有限公司。 本标准生态环境部 2018 年 12 月 26 日批准。 本标准自 2019
6、 年 6 月 1 日起实施。 本标准由生态环境部解释。 HJ 347.22018 1 水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法 1 适用范围 本标准规定了测定水中粪大肠菌群的多管发酵法。 本标准适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的测定。 本方法的检出限:12 管法为 3 MPN/L;15 管法为 20 MPN/L。 2 规范性引用文件 本标准引用了下列文件或其中的条款。凡是未注明日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。 GB/T 14581 水质 湖泊和水库采样技术指导 HJ 494 水质 采样技术指导 HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于
7、本标准。 3.1 粪大肠菌群 fecal coliforms 又称耐热大肠菌群(thermotolerant coliforms) 。44.5培养 24 h,能发酵乳糖产酸产气的需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。 3.2 最大可能数 most probable number(MPN) 又称稀释培养计数,是一种基于泊松分布的间接计数法。利用统计学原理,根据一定体积不同稀释度样品经培养后产生的目标微生物阳性数, 查表估算一定体积样品中目标微生物存在的数量 (单位体积存在目标微生物的最大可能数) 。 4 方法原理 将样品加入含乳糖蛋白胨培养基的试管中,37初发酵富集培养,大肠菌群在培养基中生长繁殖
8、分解乳糖产酸产气, 产生的酸使溴甲酚紫指示剂由紫色变为黄色, 产生的气体进入倒管中, 指示产气。44.5复发酵培养,培养基中的胆盐三号可抑制革兰氏阳性菌的生长,最后产气的细菌确定为是粪大肠菌群。通过查 MPN 表,得出粪大肠菌群浓度值。 5 干扰和消除 5.1 活性氯具有氧化性,能破坏微生物细胞内的酶活性,导致细胞死亡,可在样品采集(8.1)时加入硫代硫酸钠溶液(6.7)消除干扰。 HJ 347.22018 2 5.2 重金属离子具有细胞毒性,能破坏微生物细胞内的酶活性,导致细胞死亡,可在样品采集(8.1)时加入乙二胺四乙酸二钠溶液(6.8)消除干扰。 6 试剂和材料 除非另有说明,分析时均使
9、用符合国家标准的分析纯试剂或生物试剂,实验用水为蒸馏水或去离子水。 6.1 乳糖蛋白胨培养基。 蛋白胨 10 g 牛肉浸膏 3 g 乳糖 5 g 氯化钠 5 g 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1 ml 将蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氯化钠加热溶解于 1 000 ml 水中,调节 pH 至 7.27.4,再加入 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1 ml,充分混匀,分装于含有倒置小玻璃管的试管中,115高压蒸汽灭菌 20 min,储存于冷暗处备用。也可选用市售成品培养基。 6.2 三倍乳糖蛋白胨培养基:称取三倍的乳糖蛋白胨培养基(6.1)成分的量,溶于 1 000 ml 水中,配成三倍乳糖蛋白胨培养基,配制方法
10、同上。 6.3 EC 培养基。 胰胨 20 g 乳糖 5 g 胆盐三号 1.5 g 磷酸氢二钾 4 g 磷酸二氢钾 1.5 g 氯化钠 5 g 将上述成分或含有上述成分的市售成品加热溶解于 1 000 ml 水中,然后分装于有玻璃倒管的试管中,115高压蒸汽灭菌 20 min,灭菌后 pH 应在 6.9 左右。 注:配制好的培养基(6.16.3)避光、干燥保存,必要时在 53冰箱中保存,通常瓶装及试管装培养基不超过 36 个月。配制好的培养基要避免杂菌侵入和水分蒸发,当培养基颜色变化,或体积变化明显时废弃不用。 6.4 无菌水:取适量实验用水,经 121高压蒸汽灭菌 20 min,备用。 6.
11、5 硫代硫酸钠(Na2S2O35H2O) 。 6.6 乙二胺四乙酸二钠(C10H14N2O8Na22H2O) 。 6.7 硫代硫酸钠溶液:(Na2S2O3)=0.10 g/ml 称取 15.7 g 硫代硫酸钠(6.5) ,溶于适量水中,定容至 100 ml,临用现配。 6.8 乙二胺四乙酸二钠溶液:(C10H14N2O8Na22H2O)=0.15 g/ml 称取 15 g 乙二胺四乙酸二钠(6.6) ,溶于适量水中,定容至 100 ml,此溶液可保存 30 d。 7 仪器和设备 7.1 采样瓶:500 ml 带螺旋帽或磨口塞的广口玻璃瓶。 7.2 高压蒸汽灭菌器:115、121可调。 7.3
12、恒温培养箱或水浴锅:允许温度偏差 370.5、440.5。 7.4 pH 计:准确到 0.1 pH 单位。 HJ 347.22018 3 7.5 接种环:直径 3 mm。 7.6 试管:300 ml、50 ml、20 ml。 7.7 一般实验室常用仪器和设备。 注:玻璃器皿及采样器具试验前要按无菌操作要求包扎,121高压蒸汽灭菌 20 min 备用。 8 样品 8.1 样品采集 点位布设及采样频次按照 GB/T 14581、HJ/T 494 和 HJ/T 91 的相关规定执行。 采集微生物样品时,采样瓶(7.1)不得用样品洗涤,采集样品于灭菌的采样瓶中。清洁水体的采样量不低于 400 ml,其
13、余水体采样量不低于 100 ml。 采集河流、湖库等地表水样品时,可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶插入水中,距水面 1015 cm处,瓶口朝水流方向,拔瓶塞,使样品灌入瓶内然后盖上瓶塞,将采样瓶从水中取出。如果没有水流,可握住瓶子水平往前推。采样量一般为采样瓶容量的 80%左右。样品采集完毕后,迅速扎上无菌包装纸。 从龙头装置采集样品时,不要选用漏水龙头,采水前将龙头打开至最大,放水 35 min,然后将龙头关闭,用火焰灼烧约 3 min 灭菌或用 70%75%的酒精对龙头进行消毒,开足龙头,再放水 1 min,以充分除去水管中的滞留杂质。采样时控制水流速度,小心接入瓶内。 采集地表水、废水样品
14、及一定深度的样品时,也可使用灭菌过的专用采样装置采样。 在同一采样点进行分层采样时,应自上而下进行,以免不同层次的搅扰。 如果采集的是含有活性氯的样品,需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液(6.7) ,以除去活性氯对细菌的抑制作用(每 125 ml 容积加入 0.1 ml 的硫代硫酸钠溶液) ;如果采集的是重金属离子含量较高的样品,则在采样瓶灭菌前加入乙二胺四乙酸二钠溶液(6.8) ,以消除干扰(每 125 ml 容积加入 0.3 ml的乙二胺四乙酸二钠溶液) 。 注:15.7 mg 硫代硫酸钠(6.5)可去除样品中 1.5 mg 活性氯,硫代硫酸钠用量可根据样品实际活性氯量调整。 8.2 样品
15、保存 采样后应在 2 h 内检测,否则,应 10以下冷藏但不得超过 6 h。实验室接样后,不能立即开展检测的,将样品于 4以下冷藏并在 2 h 内检测。 9 分析步骤 9.1 样品稀释及接种 9.1.1 15 管法 将样品充分混匀后, 在 5 支装有已灭菌的 5 ml 三倍乳糖蛋白胨培养基 (6.2) 的试管中 (内有倒管) ,按无菌操作要求各加入样品 10 ml,在 5 支装有已灭菌的 10 ml 单倍乳糖蛋白胨培养基(6.1)的试管中(内有倒管) , 按无菌操作要求各加入样品 1 ml, 在 5 支装有已灭菌的 10 ml 单倍乳糖蛋白胨培养基 (6.1)的试管中(内有倒管) ,按无菌操作
16、要求各加入样品 0.1 ml。 对于受到污染的样品,先将样品稀释后再按照上述操作接种,以生活污水为例,先将样品稀释 104倍,然后按照上述操作步骤分别接种 10 ml、1 ml 和 0.1 ml。15 管法样品接种量参考表见表 1。 当样品接种量小于 1 ml 时,应将样品制成稀释样品后使用。按无菌操作要求方式吸取 10 ml 充分HJ 347.22018 4 混匀的样品,注入盛有 90 ml 无菌水(6.4)的三角烧瓶中,混匀成 110 稀释样品。吸取 110 的稀释样品 10 ml 注入盛有 90 ml 无菌水的三角烧瓶中,混匀成 1100 稀释样品。其他接种量的稀释样品依次类推。 注:吸
17、取不同浓度的稀释液时,每次必须更换移液管。 生活饮用水等清洁水体也可使用 12 管法。 表 1 15 管法样品接种量参考表 接种量/ml 样品类型 10 1 0.1 102 103 104 105 水源水 湖泊(水库) 地表水 河流 生活污水 处理前 废水 工业废水 处理后 地下水 9.1.2 12 管法 将样品充分混匀后,在 2 支装有已灭菌的 50 ml 三倍乳糖蛋白胨培养基(6.2)的大试管中(内有倒管) ,按无菌操作要求各加入样品 100 ml,在 10 支装有已灭菌的 5 ml 三倍乳糖蛋白胨培养基(6.2)的试管中(内有倒管) ,按无菌操作要求各加入样品 10 ml。 9.2 初发
18、酵试验 将接种(9.1)后的试管,在 370.5下培养 24 h2 h。 发酵试管颜色变黄为产酸,小玻璃倒管内有气泡为产气。产酸和产气的试管表明试验阳性。如在倒管内产气不明显,可轻拍试管,有小气泡升起的为阳性。 9.3 复发酵试验 轻微振荡在初发酵试验(9.2)中显示为阳性或疑似阳性(只产酸未产气)的试管,用经火焰灼烧灭菌并冷却后的接种环(7.5)将培养物分别转接到装有 EC 培养基(6.3)的试管中。在 44.50.5下培养 24 h2 h。转接后所有试管必须在 30 min 内放进恒温培养箱或水浴锅(7.3)中。培养后立即观察,倒管中产气证实为粪大肠菌群阳性。 9.4 对照试验 9.4.1
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