NY∕T 1109-2017 微生物肥料生物安全通用技术准则(农业).pdf
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1、ICS 65.080 B 10 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 1109一2017代替NY1109-2006 微生物肥料生物安全通用技术准则General biosafety standard for microbial fertilizers 2017 -12-22发布2018-06-01实施中华人民共和国农业部发布NY/T 1109-2017 目。吕本标准按照GB/T 1. 1-2009给出的规则起草。本标准代替NY1109-2006 微生物肥料生物安全通用技术准则。与NY1109-2006相比,除编辑性修改外主要技术变化如下:一彦改了半数致死量(LDso)定义;一一修改了溶血试
2、验的质控菌株要求;一彦改了菌种安全分级目录;一一增加了急性经口毒性定义;一一增加了生产用菌种需做溶血试验的要求;一一增加了植物病原菌不可用作生产菌种的要求;一一删除了引用标准GB/T4789.28。本标准由农业部种植业管理司提出并归口。本标准起草单位:农业部微生物肥料和食用菌菌种质量监督检验测试中心、农业部微生物产品质量安全风险评估实验室(北京)、中国农业科学院农业资源与农业区划研究所。本标准主要起草人:姜昕、李俊、曹凤明、马鸣超、关大伟、李力、葛一凡、杨小红、冯瑞华。本标准所代替标准的历次版本发布情况为:一一-NY1109-2006。NY/ T 1109-2017 微生物肥料生物安全通用技术
3、准则1 范围本标准规定了微生物肥料生产用菌种安全性分级目录、不同菌种及产品选择毒理学试验的原则、程序、试验方法和结果评价方法。本标准适用于中华人民共和国境内生产2 规范性引用文件下列文件对于本文件件。凡是不注日期的寻GB 15193.3 经口统计得出或克每千克4 4. 1 4.1.1 总则微生物机构鉴定。未列入附有生产用菌种释放的生物安全性有关批文。4.1.2 菌种安全分级. 啕4. 1. 2. 1 第一级(A.1)为免做毒理学试验4.1.2.2 第二级(A.2)为需做急性经口毒性试验的菌种。4.1. 2. 3 第三级(A.3)为需做致病性试验的菌种。4.1.2.4 第四级(A.4)为禁用菌种
4、。4.2 产品注日期的版本适用于本文量为经过菌种应经专业权威做毒理学试验。所,应具有允许大面积4.2.1 除有机物料腐熟剂以外的固体微生物接种剂类产品均免做毒理学试验。4.2.2 复合微生物肥料、生物有机肥和液体剂型微生物接种剂等需做急性经口毒性试验。NY/ T 1109-2017 5 毒理学试验程序5. 1 菌种毒理学试验程序5. 1. 1 应提供微生物肥料生产用菌种的鉴定资料,包括属及种的拉丁学名和中文译名、形态、生理生化特性及鉴定依据、功能评价等资料。5.1.2 根据产品所含菌种的鉴定资料,按照附录A的规定,确定菌种安全级别、是否做毒理学试验及毒理学检测项目。5.1.3 对于需要做毒理学
5、试验的菌种,生产者需提供试验用纯菌种斜面,经复核确认与该菌种鉴定资料相符且元杂菌污染后,进行毒理学试验。5.2 产品毒理学程序需对送检产品进行质量检测和载体物料的真实性确认后,进行毒理学试验。6 试验方法6. 1 受试物的准备6. 1. 1 菌种受试物将试验菌种接种于适宜的培养基中,在适宜的条件下培养一定时间,用生理盐水调整菌液浓度至2.0 X 108 CFU/mL -2. 0 x 109 CFU/mL,该溶液为菌种受试物。6.1.2 产晶受试物固体产品根据试验要求,配制所需浓度,溶剂首选去离子水,也可选用竣甲基纤维素、明胶、淀粉等。液体产品不可稀释,直接使用。6.2 急性经口毒性试验按GB1
6、5193.3的规定执行。6.3 致病性试验项目6.3.1 急性经口毒性试验按GB15193.3的规定执行。6.3.2 一次破损皮肤刺激试验6.3.2.1 目的检测受试物对实验动物皮肤的剌激/腐蚀作用和强度。6.3.2.2 实验动物每次实验至少需要3只皮肤完好的白色健康家兔或豚鼠。6.3.2.3 操作程序6.3.2.3.1 涂受试物前,将实验动物背部脊柱两侧的毛去掉,去毛范围约2.5 cm x 2. 5 cm,用75%酒精清洁、消毒暴露皮肤,待酒精挥发后,用灭菌刀片或注射针头分别在两块皮区内划一个#形的破损伤口。注意皮肤破损仅达表皮,不要伤及真皮。6.3.2.3.2 将受试物0.5mL直接滴于破
7、损皮肤上,或滴于同样大小的2层-4层纱布上并敷贴于破损皮肤表面,然后用一层元剌激塑料膜或油纸覆盖,再用元剌激胶布固定。另一侧去毛破损皮肤作为空白对照(或溶剂对照),敷贴时间为4h。试验结束后,用温水或无剌激性溶剂除去残留受试物。6.3.2.3.3 分别于去除受试物后1h24 h和48 h观察皮肤局部反应,并按表1进行剌激反应评分。注意鉴别感染和原发性剌激反应的区别,若有感染可疑,应进行重复测试。6.3.2.4 评价规定在各个观察时间点,按照表1对动物的皮肤红斑与水肿形成情况进行评分,并按时间点将3只动物2 NY/T 1109-2017 的评分相加,除以动物数,获得不同时间点的皮肤刺激反应积分均
8、值(剌激指数)。取其中最高皮肤刺激指数,按表2评定该受试物对动物皮肤剌激强度的级别。表1皮肤剌激反应的评分标准6.3.3溶6.3.3.1 检测6.3.3.2 用元h后63303等作为6.3.3.3 菌落周围有自6.3.4 抗菌药物敏感6.3.4.1 目的检测受试物对抗菌药物的6.3.4.2 试验用抗菌药物可选用头抱K酣(CFP)、四环素(TE)、头抱瞠琳(CZ)、链霉素(S)、病特灵(FR)、环丙沙星(CIP)、复方新诺明(SXT)、氯霉素(C)、氨节青霉素(AM)、庆大霉素(GM)、强力霉素(DO)、丁胶卡那霉素(AN)、甲氟赈酸(PEF)、氟院酸(ENO)、多西环素(DO)、依诺沙星(EN
9、O)、阿米卡星(A町、黄连素(Ber-berine hydrochloride)、两性霉素B( Amphotericin 町、伊曲康瞠(Itraconazole)等抗菌药物。6.3.4.3 操作程序6.3.4.3. 1 用元菌棉拭子将受试物均匀涂抹于营养琼脂平板表面,共3次。每涂抹1次,平板应转动600,最后将棉拭子绕平板边缘涂抹1周。盖好平皿,置室温干燥5min。皮肤刺激反应评分nuA句,.句、dd斗皮肤刺激反应红斑形成:无勉强可见明显红斑中等至严重红斑紫红色红斑并有焦癫形成水肿形成:无勉强可见皮肤隆起,轮廓清楚水肿隆起不超过水肿隆起超过13 NY/ T 1109-2017 6.3.4.3.
10、2 用无菌棉拭子蘸取浓度为2.0 X 108 CFU/ mL -2. 0 X 109 CFU/ mL质控菌株菌悬液,均匀涂抹于营养琼脂平板表面,具体方法同6.3.4.3.1,作为对照试验。6.3.4.3.3 以无菌操作取出抗菌药物纸片分别贴在涂有受试物和质控菌株菌悬液的平板培养基表面,每个平板放4个纸片。然后将平板置于(36:t 1 ) c恒温培养箱中培养18h后观察抗菌药物纸片周围有无抑菌环,量取并记录其直径(包括纸片直径)大小,单位为毫米(mm)。试验应做3个平行,取其均值。6.3.4.3.4 质控菌抑菌环应均在质控范围内,说明试验方法准确可靠,否则试验无效。质控菌株可选用大肠埃希氏菌AT
11、CC25922等标准菌株。6.3.5 急性腹腔注射致病性试验6.3.5.1 目的检测受试物的急性致病性。6.3.5.2 试验动物清洁级健康成年昆明小鼠(Kunmingmice)或BALB/c小鼠(BALB/ c mice)。6.3.5.3 操作程序选健康成年小鼠40只,体重18 g- 20g,雌、雄各半,剂量为500mg/ kg,按0.1mLlIO g经腹腔注射受试物。于腹腔注射后第3d、第7d分别取存活的实验动物雌、雄各5只解剖,并做大体病理学观察。腹腔注射后第14d将剩余实验动物处死、解剖并做大体病理学观察。6.3.5.4 结果观察、评价根据试验周期内动物有无死亡及出现的中毒体征、大体病理
12、学观察及病理组织学检查发现病变的程度进行分级判定(见表3)。级别强致病性弱致病性无致病性6.3.6 急性眼剌激试验6.3.6.1 目的表3急性致病性判定标准判定依据动物出现死亡,死亡动物及24 h以上存活动物在第3d、第7d经解剖肉眼检查和病理组织学检查即可发现脏器的明显病变动物有中毒体征无死亡,动物第14d经解剖肉眼检查和病理组织学检查可发现脏器的明显病变动物无中毒体征元死亡,动物第14d经解剖肉眼检查和病理组织学检查均未发现脏器的明显病变检测受试物对实验动物眼睛的急性剌激和腐蚀作用。6.3.6.2 实验动物新西兰家兔3只,体重1000 g - 1 500 g,试验前检查家兔双眼,有异常者不
13、能用于试验。6.3.6.3 操作程序吸取受试物0.1mL,滴人家兔一侧眼结膜囊内,另一侧眼以生理盐水作为正常对照。滴受试物后,将眼被动闭合4s,30 s后用生理盐水冲洗。于滴眼后1h24 h、48h、72h7d14d和21 d,肉眼观察家兔眼角膜、虹膜和结膜的损伤与恢复情况。如果72h内未出现剌激反应,或第7 d或第14 d,眼睛剌激反应完全恢复,即可提前终止试验。必要时,用2%荧光素铀溶液或裂隙灯、放大镜检查角膜及虹膜变化。6.3.6.4 评价规定按表4对家兔眼角膜、虹膜和结膜的急性刺激反应进行评分,并分别计算每只动物在3个不同观察4 NY/T 1109-2017 时间(24h、48h和72
14、h)角膜损害、虹膜损害、结膜充血和结膜水肿四方面的平均评分(即每只动物的24 h、48h和72h评分之和除以观察数3)。分别以动物眼角膜、虹膜和结膜充血、水肿的平均评分和恢复时间进行评分,按表5或表6眼剌激反应分级标准判定受试物对眼睛的剌激强度。表4急性眼剌激反应的评分标准-:2,评分nu-句,&句JAUTnuA句,&眼损害表现角膜损害:无溃殇形成或混浊散在或弥漫性混浊,虹膜清晰可见半透明区易分辨,虹膜模糊不清出现灰白色半透明区,虹膜细节不清角膜不透明,混浊,虹膜损害:正常皱榴明显加深,出血、肉眼可结膜(险结膜、血管正常可逆性损伤接触受试物后所产生的可逆性炎性反应。接触受试物后所产生的不可逆性
15、组织损伤。损伤类型无刺激性眼剌激性反应分级标准表6恢复时间.,d 动物数,只,;21 ;.2 平均评分虹膜损害1和结膜充血21 结膜水肿二d为动物刺激反应评分恢复至角膜损害=0、虹膜损害=0、结膜充血运1 、结膜水肿运1的时间。b 至少有1只动物于21 d尚存在角膜粘连或血管弱,也可判为腐蚀性。7 结果评价7. 1 总则损伤类型轻刺激性刺激性腐蚀性b凡有毒或致病性试验结果不符合的菌种(株),均不得作为微生物肥料生产用菌种;毒理学试验结果评价为有毒的产品,不得生产和销售。7.2 急性经口毒性试验描述由中毒表现初步提示的毒作用特征,根据LDso值确定受试物的急性毒性分级(见附录B)。凡LDso 5
16、 000 mg/ kg的,可通过,即该菌种可作为生产用菌种或该产品可进行生产、销售。7.3 致病性试验7.3. 1 急性经口毒性试验结果判定同7.2。7.3.2 一次破损皮肤剌激试验如结果为无剌激或仅具轻度剌激作用,可通过;否则,应放弃使用。7.3.3 溶血试验溶血试验结果为阴性的,可通过;否则,应放弃使用。7.3.4 抗菌药物敏感试验受试菌株必须对2种以上的抗菌药物敏感;否则,应放弃使用。7.3.5 急性腹腔注射致病性试验结果为元急性致病性可通过;否则,应放弃使用。7.3.6 急性眼剌激试验结果对眼无剌激性或具有轻剌激性的,可通过;否则,应放弃使用。6 NY/ T 1109-2017 A.1
17、 第一级:免作毒理学试验的菌种A. 1. 1 根瘤菌类Azorhi.zobium culinodans Azorhi.zobium doebereinerae Bradyrhi.zobium betae Bradyrhi.zobium diazoefficiens Bradyrhi.zobium elkanii Bradyrhi.zobium japonicum Bradyrhi.zobium liaoningense Bradyrhi.zobium sp. (Arachis hypogae) Bradyrhi.zobium sp. (Vigna radiata) Bradyrhi.zob山n
18、yz皿nmmgenseMesorhi.zobium huakuii Mesorhi.zobium loti Rhi.zobium etli 附录A(规范性附录)菌种安全分级目录茎瘤固氮根瘤菌(回香固氮根瘤菌)德式固氮根瘤菌甜菜慢生根瘤菌有效馒生根瘤菌(高效固氮慢生根瘤菌)埃氏慢生根瘤菌日本慢生根瘤菌(大豆慢生根瘤菌)辽宁慢生根瘤菌(慢生大豆根瘤菌)花生根瘤菌绿豆根瘤菌圆明园慢生根瘤菌华葵中间根瘤菌百脉根中间根瘤菌豆根瘤菌(埃特里根瘤菌)Rhi.zobium fabae 蚕豆根瘤菌Rhi.zobium galegae 山羊豆根瘤菌Rhi.zobium leguminosarum 豌豆根瘤菌Sin
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