NY∕T 2724-2015 甘蔗脱毒种苗生产技术规程(农业).pdf
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1、ICS 65.020 B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 2724一2015甘震脱毒种苗生产技术规程Technique regulation for virus-free plantlet production of sugarcane 2015-05-21发布2015-08-01实施中华人民共和国农业部发布目IJ1=1 本标准按照GB/T1. 12009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准起草单位:浙江省农业科学院。本标准主要起草人:陈剑平、陈志、汪一婷、牟豪杰、吕永平。NY/T 2724一2015I NYjT 2724-2015 甘震脱毒种苗生产技
2、术规程1 范围本标准规定了甘煎脱毒种茵的术语和定义、脱毒种苗生产、甘煎种苗病毒检测种类及方法、种苗包装、运输等要求。本标准适用于甘震脱毒种苗生产。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。NY/T 1796 甘荒种苗NY/T 2306 花卉种苗组培快繁技术规程3 术语和定义3. 1 3.2 3. 3 3.4 下列术语和定义适用于本文件。甘震脱毒种苗sugarcane virus-free plantlet 经检测确定不携带指定病毒的甘荒种苗。组培瓶苗in-唔arp
3、lantlet 生长在固体培养基(凝固剂一般为琼脂)中的组培生根苗。无琼脂苗ex-agar plantlet 从培养容器中取出并洗去表面培养基的组培生根苗。穴盘苗plug plantlet 穴盘中移栽成活的甘震组培苗。4 脱毒种苗生产流程4. 1 无菌材料的获得4. 1. 1 外植体材料的选择选择具有待生产品种典型性状、无明显病虫害、品种纯正的健壮植株,切取顶芽及饱满带节间腋芽。4. 1.2 外植体处理、消毒及接种4. 1. 2. 1 外植体处理顶芽及带节间腋芽切成约1cmX1 cmX1 cm大小的块状,剥去外面2层3层包被鳞(叶)片。4. 1.2.2 清洗预处理好的外植体,用洗洁精溶液浸泡井
4、振荡10min20 min,然后在自来水下流水冲洗15min 20 min 4.1.2.3 z;醇溶液处理1 NY/T 2724-2015 在准备好的超净台上,将清洗后的外植体转移到无菌锥形瓶中,倒人70%75%乙醇溶液没过外植体表面1cm,轻摇锥形瓶以除去植物材料表面气泡,30s60 s后将酒精倒去,用元菌水冲洗外植体3次。4. 1.2.4 次氯酸铀处理用有效氯浓度O.5%1. 0%的次氯酸饷珞液浸泡经乙醇将军液处理的植物材料,浸泡过程中不断轻摇锥形瓶以除去外植体表面气泡,10min 15 min后,倒出次氯酸饷溶液,植物材料用无菌水清洗3次5次后备用。4. 1.2.5 氯化柔处理经70%7
5、5%乙醇榕液处理的植物材料也可用0.1%氯化录榕液代替次氯酸铀洛液进行表面消毒,浸泡时间为8min 10 min,后续清洗同次氯酸纳处理。4. 1.2.6 外植体接种在超净工作台上取出灭过菌的接种盘,在接种盘内放置1张2张无菌滤纸,用冷却、元菌的接种器械将经过表面消毒的植物材料取出(每次取3个5个),放在元菌滤纸上吸干材料表面水分。然后将外植体接入外植体萌发培养基(参见附录剖,1瓶接种1个外植体,封口。4. 1.3 外植体培养接种完成后统一贴上标签,注明品种、接种日期、接种培养基等信息,放在组培用托盘内,送人培养室进行培养,培养温度控制在(25士3)OC,光照强度25mol m-2 S-l 4
6、0mol. m-51,光照时间每天不低于12h,培养期间及时去除被污染材料。4. 2 不定芽诱导和增殖4.2. 1 不定芽诱导由4.1得到的高约1.5 cm2. 5 cm的无菌、成活芽萌发材料,在无菌工作台上从芽基部与母体分离,然后接种在不定芽诱导培养基中,培养环境同4.1. 30 4.2.2 不定芽增殖由4.2. 1获得增殖良好的簇生甘煎培养材料,在无菌工作台上以3个4个不定芽为接种单位从基部进行分离(芽高度控制在2.0 cm3. 0 cm),然后接种在不定芽增殖培养基中,培养环境同4.1.3。每25d30 d继代1次。4. 3 茎尖培养4. 3. 1 材料选择选择经由4.2. 2连续培养获
7、得的健壮、元菌不定芽。4.3.2 茎尖剥离在元菌条件下,将簇生不定芽从基部单个分离,并自芽基部以上0.5cm左右处切断,选取芽基部分进行茎尖剥离。在体视镜下用元菌解剖刀小心逐层剥离外层叶革肖,直至露出长约O.3 mmO. 5 mm的茎尖,然后更换为元菌且未使用过的解剖刀将茎尖从母体材料切下.立即接种于茎尖伸长培养基中。4. 3. 3 茎尖伸长培养将4.3.2接种好的甘庶茎尖置于(23士3)OC,光照强度10/Lmol m-2 S-l 20 /Lmol m-2 S-l, 光照时间每天不低于12h。4.3.4 不定芽诱导茎尖伸长生长至1.5 cm2. 0 cm后即可接种到不定芽诱导培养基中,培养环
8、境同4. 1.3。对每一个成活茎尖材料进行编号。4. 3. 5 再生材料增殖将4.3.4获得的不定芽接种到不定芽增殖培养基中,培养环境同4.1.3。每25d30 d继代1次。4. 4 茎尖培养再生植株病毒检测NY/T 2724-2015 4.4. 1 检测病毒种类本标准检测病毒包括甘震花叶病毒(Sugarcanemosc virus, SCMV)、高粱花叶病毒(Sorghummosaic virus , SrMV) ,甘震黄叶病毒(Sugarcaneyellow leaf virus, SCYLV)和甘震杆状病毒(Sugarcane bacilliform virus ,SCBV)。4.4.2
9、 材料选择茎尖培养再生材料增殖到10株15株后,按照4.3.4的要求对应编号,选取叶片为检测材料,对每个编号株系的茎尖再生材料进行病毒检测。4.4.3 检测方法检测方法参见附录B。检测所需仪器设备及试剂参见附录c4.4.4 脱毒材料确认连续3代检测均同时不携带4种检测病毒的甘庶组培材料即被确认为脱毒材料(不定芽L4.4.5 不合格材料处理不合格材料在未打开培养瓶情况下经1210C、101kPa灭菌30min后再废弃。5 脱毒不定芽扩繁5. 1 脱毒不定芽扩繁经4.4.4确认的脱毒不定芽按照4.2.2的方法进行增殖。5.2 脱毒不定芽保存脱毒不定芽扩繁材料可移至(18士2)OC,光照强度20mo
10、l.m-z S-1 30mol. m-z S-I,光照时间10h12 h环境中进行长期保存。每90d继代1次,可继代保存12代15代。6 生根诱导将株高二三3cm的簇生脱毒不定芽在元菌工作台上从基部进行单个分离,以单个不定芽为单位接种到生根诱导培养基中,培养环境同4.1.3。7 炼苗、移栽及管理7. 1 炼苗时期室外温度为100C300C之间均适合甘藤组培苗移栽。7.2 基质准备及消毒将不同基质按一定比例混配均匀,装入穴盘中并稍压紧,用0.5g/L的多菌灵(80%可湿性7J剂)溶液浸透后捞出或喷透备用。7. 3 组培苗炼苗7.3. 1 炼苗标准培养瓶内甘煎组培苗高二三5cm,基部长出6条10条
11、1cm1. 5 cm长的白色不定根,即可进行炼苗。7. 3. 2 炼苗温室中,培养瓶在自然环境条件下培养3d7 d。7.4 移栽轻轻取出组培苗,放入清水中(水温180C200C) ,组培苗洗干净表面培养基后稍晾干,然后栽于装好基质的穴盘中,覆盖物或基质以刚盖过组培苗基部为宜,稍压实,以幼苗不倒即可,移栽好的穴盘分品种、移栽日期,在苗床上整齐摆放。7. 5 管理3 NY/T 2724-2015 7.5. 1 水肥管理移栽2周4周内,相对湿度控制在75%90%,当第一片新叶完全张开后,逐渐降低湿度。4周6周后,相对湿度保持在60%85%,光照强度控制在60mol m-2 S-1 100mol m-
12、2 S-1。移栽第4周8周内,每隔7d喷施液肥一次,移栽8周后,视植株生长情况酌情施肥。7. 5. 2 病虫害防治移栽4周后,每周喷施75%百菌清可湿性粉剂或80%多菌灵可温性粉剂1000倍1250倍液1次;移栽8周后,追施2.8%阿维菌素乳剂2000倍液防治线虫。温室内宜均匀悬挂黄色诱虫板,悬挂高度应高于穴盘苗15cm,密度以每20m2悬挂1张25cmX40 cm大小的诱虫板为宜。8 种苗质量要求和检查判断规则8. 1 种苗类型种苗类型包括组培瓶苗、元琼脂苗和穴盘苗。8. 2 抽样方法及数量据NYjT 1796,不同种茵类型脱毒种苗检测采取随机抽样,不同样品抽样数量见表1,其中组培瓶苗以瓶为
13、单位,元琼脂苗和穴盘苗以株为单位。表1抽样数量种苗数量抽样数量不超过100020 不超过500040 不超过1000060 超过1000080 一一8. 3 判定规则8. 3. 1 整体要求据NYjT2306,种苗株形丰满、完整、粗壮、挺直有活力,叶色正常,根系发达、健壮,整齐度95%以上,无污染及典型病虫害症状。8.3.2 质量标准据NYjT1796,脱毒种苗按质量要求分一级和二级,低于工级的脱毒种苗不应作为商品苗,不同类型脱毒种苗等级规格划分见附录D。8. 4 不合格苗处理病毒检测不合格的,组培瓶苗处理方法同4.4.5,元琼脂苗和穴盘苗律采用焚烧方式处理。9 包装、标签及运输9. 1 包装
14、9. 1. 1 一般情况下,种苗包装过程中需保湿,防挤斥、倒置,包装盒内温度保持100C250C。9. 1.2 如客户或订单有明确要求,应按照客户或者订单要求进行包装。9. 2标签包装箱上应贴上标签,注明品种名称、等级、规格、数量、产地、出苗日期、目的地、联系人、联系方式、注意事项等。9.3 运输装车时包装箱切勿倒置,运输途中温度保持100C250C,应在5d内到达目的地。4 NY/T 2724一2015附录A(资料性附录)甘靡不同组培阶段参考培养基及配制方法A.1 甘震不同组培阶段参考培养基外植体萌发培养基:MS十0.1mg/L 6-BA十0.1mg/L NAA+200 mg/L AC; 不
15、定芽诱导培养基:MS+O.2 mg/L 6 - BA+O. 05 mg/L NAA十100mg/L AC; 不定芽增殖培养基:MS十0.5mg/L 6 - BA+O. 1 mg/L NAA; 茎尖伸长培养基:MS+O.05 mg/L 6 - BA+O. 05 mg/L NAA+50 mg/L AC; 生根诱导培养基:MS十0.2mg/L IBA+200 mg/L AC; 不同阶段培养基煎糖含量均为30g/L,分装前培养基pH调整为5.75. 80 AC为活性炭。注:不同甘廉品种植物生长调节剂及AC用量略有不同。A.2 MS母班成分见表A.1。母液种类试剂名称硝酸御硝酸镀大量元素磷酸一氢仰七水硫
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