NY∕T 3152.4-2017 微生物农药 环境风险评价试验准则 第4部分:鱼类毒性试验(农业).pdf
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1、ICS 65.020 B17 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3152.4一2017微生物农药环境风险评价试验准则第4部分:鱼类毒性试验Risk assessment test guidelines for microbial pesticide-Part 4: Fish toxicity test 2017 -12-22发布2018-06-01实施中华人民共和国农业部发布NY/T 3152.4-2017 目U吕NY / T 3152 (微生物农药环境风险评价试验准则分为6个部分第1部分:鸟类毒性试验;一一第2部分:蜜蜂毒性试验;一一第3部分:家蚕毒性试验;一一第4部分:鱼类毒性试验
2、;一一第5部分:搔类毒性试验;一一第6部分:藻类生长影响试验。本部分为NY/T3152的第4部分。本部分按照GB/T 1. 1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由农业部种植业司提:J:并归口。本部分起草单位:农业部农药检定所、环境保护部南京环境科学研究所。本部分主要起草人:曲甏苦苦、卡元卿、田丰、周艳明、续卫和l、瞿唯刚、姜锦林。I 微生物农药环境风险评价试验准则第4部分:鱼类毒性试验1 范围本部分规定了微生物农药要求。本部分适用于微生2 规范性引用文件3.1 微生是以细菌有害生物作用3.4 细菌芽抱、真菌袍子、细显微
3、镜下一个完整的个体完整的实体。3.5 细菌营养体吨etativebacterium 单个活的生物体,通常是指自旨在合适的培养基上形成一个CFU的实体。3.6 原生生物protozoa 原生生物门各个成员的-个完整的营养体、袍子或抱囊。3.7 病毒virus 显微镜下一个完整的病毒颗粒或包涵体。NY/T 3152.4-2017 、试验报告等的基本、草、鼠等or pr侃侃oancyst 成单个CFU的一个-NY/T 3152.4-2017 3.8 最大危害暴霆量maximum hazard e碍。surelevel 微生物农药有效成分在环境中对非靶生物可能产生危害的最大暴露聋,通常以预测暴露量与安
4、全系数的乘积来表示。3.9 毒性toxicity 微生物和/或毒素引起受试生物中毒或病变的能力。其作用过程不一定同时发生微生物的感染、复制和生命活动。3. 10 致病性pathogenicity 微生物感染宿主后,在宿主体内存活及繁衍,对宿主造成损伤或病变的能力,通常与宿主的耐受性或敏感性有关。3. 11 半数致死量median lethal d翩。rconcentration, LD5tl / LCso 在规定时间内,通过指定感染途径,使一定体重或年龄的受试生物半数死亡所需最小微生物数量或毒素量。3. 12 半数感染量median infective dose or concentratio
5、n, IDs. / ICs. 在规定时间内,通过指定感染途径,使一定体重或年龄的受试生物半数感染所需最小微生物数量或毒素量。4 试验概述在一定试验条件下,以一定的供试物浓度或剂量测试对受试鱼类的毒性和致病性等影响。当供试物最大危害暴露量出现对受试生物50%及以上的个体死亡或致病时,则还需进行剂量效应试验和致死(病验证试验。致死毒性以LDs./LCso表征;致病性以ID5./ICs.表征。5 试验方法5. 1 材料和条件5. 1. 1 试验生物推荐鱼种为斑马鱼(Brachydoniorerio)、倒(Carassiusauratus )、鲤(Cyprinuscarpio)、虹蹲(Qncorhyn
6、chus mykiss)、青鳞(Oryziaslatipes)或稀有酬绅(Gobiocyprisrarus)等。受试鱼要求健康无病,未性成熟的当年生幼鱼,并采用满足其生理要求的驯养和试验条件。具体体长和适宜水温见附录A。并根据以下原则选择受试鱼:一一尽可能与微生物农药靶标宿主分类地位相近;一一选择以微生物农药靶标生物为食的鱼类;一一生物学资料丰富的鱼种;一一选择幼年期的试验物种,避开产卵期。受试鱼类应在测试环境条件下驯养7d14d,每日光照12h-16 h,每天定时喂食1次-2次,及时清除粪便及食物残渣。试验前24h停止喂食。5. 1.2 供试物5. 1.2. 1 类型微生物母药、制剂产品等。
7、2 NY/T 3152.4-2017 5. 1.2.2 批次通常情况下,试验中供试物应采用同一批次的产品。但在不得不使用另一批次产品时,应在试验报告中记录供试物的批次。5. 1. 2. 3 计数方法计数方法如下:一一细菌可采用平板菌落计数法、荧光定量PCR等测定;真菌抱子以CFU为计数单位,可采用平板菌落计数法或血球计数板法等测定;一一原生动物以个体数目-一病毒以包涵一一其他单位,以上推荐计数方法,5. 1.3 主要仪器设备超净工作台。灭菌锅。显微镜。解剖镜。5. 2. 3 处理组和对照组试验设置供试物处理组、空白对照组柑贸m宣4个平行,每个平行10尾鱼。考虑微生物的传染性,各处理组及对照组应
8、避免交叉污染。5. 2. 4 效应观察试验期间每日对受试鱼的饲料食用状况、异常行为、死亡等进行观察和记录。当鱼没有任何肉眼可见的活动,如鲸l呼吸、碰触尾鳝无反应,即可判断该鱼己死亡。5. 2. 5 试验周期试验观察时间应持续30 d。当在试验观察时间末期,处理组受试鱼开始出现死亡或明显病征,则需延长试验观察时间,直至受试鱼恢复正常或确定死亡。5.2.6 最大危害量暴露量试验以下列不同暴露途径分别设置供试物最大危害暴露量。当因制剂剂型、水质等条件限制,供试物溶NY/ T 3152.4-2017 液浓度不能达到最大危害暴露量时,则采用供试物在水中能配置得到的最大量进行试验。试验开始后,每日观察并记
9、录受试鱼的中毒症状及死亡情况。当受试鱼在试验期间未发生死亡(病变)或死亡(病变)率不超过50%.则无需进行剂量效应试验和致死(病)验证试验。不同暴露途径供试物最大危害暴露量分为:a) 接触暴露量。供试物最大危害暴露量试验浓度为10单位/mL.或按照供试微生物农药推荐施用量在15cm 7.1.体中浓度的1000倍计算设计最大危害暴露浓度。两者均能达到时,以较高浓度为最大危害暴露量。b) 饲喂暴露量。供试物最大危害暴露量试验浓度为供试微生物农药推荐施用量在15cm深水体中浓度的100倍,将供试物添加到饲料中连续饲喂5d后,正常饲喂至试验结束。c) 腹腔注射暴露量。供试物最大危害暴露量为供试微生物农
10、药推荐施用量在15cm深水体中浓度的10倍,注射量为每克体重0.01mL。5.2.7 剂量效应试验根据最大危害暴露量试验结果,按一定比例间距设置5组7组供试物系列浓度,将受试鱼暴露于不同浓度的供试物下,试验开始后,每日观察并记录受试鱼的中毒症状及死亡情况,求出试验结束时供试物对受试鱼类的LDso/LCso值或IDso/ICso值及其95%置信限。5. 2. 8 致死(病)验证试验在无菌条件下将死鱼或病鱼进行表面消毒后解剖,分离感染组织并接种至适合的培养基质中,将培养物置于适宜目标菌株生长条件下培养,分离纯化疑似菌株,疑似菌株经形态学、生理生化及核酸等方法鉴定并确认为目标菌株后,再以相同暴露途径
11、感染健康的受试鱼。如果受试鱼出现与先前试验相同的病症,则证实目标菌株对受试鱼类具有致死(病)能力。5. 3 数据处理5.3. 1 统计方法选择试验结果的数据处理可选择5.3. 2、5.3.3中所述的统计学方法,也可根据试验情况选择其他合适的统计方法。5. 3. 2 差异显著性检验5.3. 2. 1 概述差异显著性检验推荐采用独立样本t检验或单因子方差分析CF检验One-WayANOVA. LSD检验)等。显著水平取0.05C差异显著)、0.01C差异极显著)。5.3. 2. 2 独立样本t检验2组均值比较时可进行独立样本t检验。独立样本t检验按式(1)计算。X1- X2 . (1) zzz l
12、 式中:主1,X2分别为两样本平均数;1., .1., 分别为两样本方差;n 一一样本容量。5.3. 2. 3 One-Way ANOVA方差分析(LSD检验)3组及以上均值比较时可进行方差分析.LSD检验按式(2)计算。LSD. = t.df,l S王J.(2) 式中:ta(dfe)一一在F检验中误差自由度下,显著水平为的临界t值;4 NY/T 3152.4-2017 S二-玉,一一均数差异标准误,按式(3)计算。S玉-i,= j2MS,/可.(3) 式中:MS,-F检验中误差均方;n 一一各处理重复数。5. 3. 3 半数敖死量或半数感染量计算鱼类半数致死量LCso/LD5。或半数感染量图
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