NY∕T 3307-2018 动物毛纤维源性成分鉴定 实时荧光定性PCR法(农业).pdf
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1、ICS 59.140.20 X45 NY 中华人民共和国农业行业标准/T 3307-2018 动物毛纤维源性成分鉴定实时荧光定性PCR法Identification of animal- derived materials in wool fibers一Qualitative reaItime PCR method 2018-12-19发布2019-06-01实施?二中华人民共和国农业农村部发布前言本标111按照GB!T1. 1-2009给出的规则起草.本标111由农业农村部畜牧兽医局提1-1。本标叫i由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC274)归口。本标准起草单位山东省农业科学院生物技
2、术研究中心。NY!T 3307-2018 本标准主要起草人:张全芳、主1)艳艳、范阳阳、1扭j悦、马德源、王俊燕、李费、杨雪、.III古时i、陈雪l!、刘国(1)、步迅、王兴军。I NY/T 3307- 2018 动物毛纤维源性成分鉴定实时荧光定性PCR法范围本标准规定了对水貌、狐狸、兔、骆驼、山羊、绵羊、鸭和鹅8利动物毛纤维iEl性成分进行鉴定的实时荧光定性PCR法。本标阳日子动物毛纤维中喝画画踊谢谢蘸蜘238阳、性成分的定性检测。本方法检:J:l限为1%。2 规范性引用文件下列文件对件。凡是不注日期GB/ T 6682 GB/ T 3 3.2 4 原理根据线粒体16采用TaqMan犯、兔、
3、骆驼、山羊、绵羊、5 试剂或材料、. |除另有规定外,仅使用分析纯试剂。5. 1 水,GB/T6682,一级。进行定特异性探针,阔值,要1)定水貌、狐5.2 1 mol/ L Tris -J-IC1(pJ-I 6.4)溶液:称Jt且12.1 g Tris fl.于100mL烧杯中,加入80mL 水,用浓HCl 调节p-至6.4,jJII水定容至100mL, 103. 4 kPa蒸汽压021c)灭菌20min,室温保存待用。5.3 1 mol/ L Tris -J-IC1(pJ-I 8.0)溶液称以12.1 g Tris置于100mL烧杯中,加入80mL 水,用浓-Cl调节pH至8.0,加水定容
4、至100mL, 103.4 kPa蒸汽压021C)灭菌20min,室温保存待用。5.4 0. 5 mol/ L EDTA(pJ-I 8.0)溶液:称Jlil.18.61 g Na,EDTA 2H20置于100mL烧杯中,加入80mL水,HJ 10%的NaOH榕液,调节pI-至8.0,加水定容至100mL, 103. 4 kPa蒸汽压021C)灭菌20 min.窒源保存待用。NY/T 3307- 2018 5.5 10%十二烧基硫酸俐。DS)溶液:称取10g SDS溶解于80mL无菌水中,j111水定容至100mL。储存于灭茵过的容器中待用。5. 6 5 mol/ L NaCI溶液:称取29.2
5、2g NaCI溶解于80mL无菌水中,加水定容至100mL, 103. 4 kPa 蒸汽压Cl21C)灭菌20mn,室温保存待用。5. 7 细胞裂解液CLysisBuffer)取1mol/ L Tris -I-ICI C pI-l 8.0)浴液20mL, O. 5 mol/ L EDT A C pI-l 8.0)溶液5mL,5. 0 mol/L NaCI浴液10mL, 10% SDS浴液5mL,j1U水定容至100mL,混匀。5.8 20 mg/mL蛋白酶K溶液,准确称量0.2g蛋白酶冻干品,jJD无菌水溶解,加水定容至10mL,分装后于-20C保存。5.9 RNA酶浴液将1g r!i丁干品R
6、NA酶A溶解于6mL元菌水中,于100C加热15min,缓慢冷却至室温,力11水定容至10mL,分装成小份存于一20C。5.10 1 mol/L二硫苏:f1.lfj:CDTT)准确称盐1.543 g DTT, j1ll人6mL 7./(溶解,jJU水定容至10mL,分装后于20C保存。5. 11 5 % Chelex -100树脂粉取5g Chelex -100树脂,浴解于100mL 水中。5. 12 硅珠悬浮液取5g的硅l快加入到20mL的水中充分混合,静止24 h,弃掉上消液,然后再加入20 mL的水中充分混合,再静止5h,弃掉上清液。在沉淀的硅珠中加入5mL的水,再加入5L的浓盐殴,充分
7、混合,调节pI-l至2.0。5. 13 DNA结合液CBindingBucr) ,称取60 g异硫低自主JliIICGUSCN),加入5mL 1 mol/ L Tris - HCI CpH 6. 4)溶液,再加入8mL O. 5 mol/ L EDTACpI-l 8.0)浴液,再加入4mL聚乙二醇辛基苯隧CTrition X - 100) (温度在60C),加水定容至100mL。5.14 擦洗液CWashinguffer),粉取60g异硫c酸腻,如l人5mL 1 mol/ L Tris - HCI(pI-l 6.4)浴液,再加入8mL O. 5 mol/ L EDTACpI-l 8.0)溶液,
8、加水定容至100mL 5. 15 70%乙醇:蓝眼70mL无水乙醉,加入30mL水。5. 16 TE缓冲液将0.5mL J 10 mmol/ L Tris一HCICpH8.0)溶液、0.1mL的0.5mol/ L EDTA CpI-l 8.0)济液加入到50mL容量瓶中,调pH8.0,加水定容,103.4kPa蒸汽压(l21C)灭菌20min,降至室温,4C保存备用。5. 17洗毛剂取100mL 5%的原液,jm7./(900 mL 5. 18 7.K貌、狐狸、兔、骆驼、山羊、绵羊J鸣和鹅8利t动物源性成分实时荧光PCR检测试剂盒试剂,2XTaqManMastcr Mix,含有TqDNA聚合f
9、j!J(终浓度1U/20L)、Mg+C终浓度2.0mmol/L)、dNTPs(终浓度0.2mmol/L)。水号召、狐狸、兔、骆驼、山羊、绵羊、鸭和鹅8利动物源性基因组DNA阳性标准晶。6 仪器设备6. 1 实时荧光定量PCR仪。4通道以上。6. 2 紫外分光光度计波长190nm900 nm 6. 3 分析天平:感量。1mg 6. 4离心机最大转速13000g。6. 5 振荡型恒lliil金属浴,OC 100Co 6. 6 高压灭菌锅。6. 7 冰箱20C4C. 6. 8 超净工作台。6. 9 微量移液器,100Ll000L,10L200L,21L20L,0.5LlOL。2 NY/T 3307-
10、 2018 7 检测用引物和探针内参引物探针序列及水绍、狐狸、兔、骆驼、111羊、绵羊、鸭和鹅B种动物(j通用引物年11特异性探针序列见附录A中的表A.l 。引物探钊在序列中的位;在参见附录Bo8 试验步骤8 1 取样从毛纤维制品的不同部位共约19中,用超声波清洗干净。Jt 5 min,8 000 心1min,弃去次。8000g (5.16)溶解新离心管中,用8.3. 1 8. 3. 1 2 8. 3. 2 对照实时荧光a) b) 空白对!骂:以水作为空臼对Jm;5 mn,真空干:睐。用剪刀3 min,l仅上/00,比1-3种动物源c) 阳性对!l,将水绍、狐狸、兔、骆驼、山羊、绵羊、鸭和鹅8
11、种动物基凶组DN等:!i!:昆匀作为阳性对!IL注每个PCR反应设置3次平行.8. 3. 3 实时荧光PCR反应体系配制分别按照表人2、表 A.3,表A.4和表A.5依次加入试剂,配制PCR反应体系,混匀离心分装至PCR反应管中,加入模板DNA,3000g离心1min,l仅LI.iPCR笆,放入荧光定:W:PCR仪10 8. 3. 4 实时荧光PCR反应程序950C预变性3min;950C变性10s,6ZC退火延伸35s(收集荧光信号),40个循环。3 NY/T 3307-2018 9 试验数据处理9. 1 对照检测结果分析空内对!、阴性对!臣和阳性对!全部满足下述条件,表明PCR体系有效.a
12、) 空白对!H,A、B、C、04主ItPCR体系对应的反应孔均无FAMJOE、CY3和CY5荧光的典型布增l山线,b) 阴性对!m,八、B、C、04组PCR体系对应的反应孔均元FAM,JOE、CY3荧光的典型扩增曲线,而CY5有典型扩增rUr线,且Ct值:0;35.0;c) 阳性对!黑八、B、C、04组PCR体系对应的反应孔中均出现FAMJOE、CY3和CY5荧光的典型扩增rUr线,且Ct值:0;35.009.2 样品检测结果分析和表述9.2. 1 在PCR反应体系有效旦内参基因出现典型扩增rUl线(Ct值:0;35.0)的情况下,当有F八M,JOE、CY3荧光扣增rllr线出现,若Ct值:0
13、;35.0,则判定样品中检lIJ相应的动物源性成分,若元典型扭增l曲线,则判定样品中米检:1-:相应的动物源性成分。9.22 在PCR反应体系有效且内参基因出现典型扩增rtlr线(Ct值:0;35.0)的情况下,当有FAMJOE、CY3荧光扩增rtlr线州现,但35.0Ct值40.0,则需要重新提取ONA加大模板量进行PCR反应。若再次扩增后的Ct值40.0,则判定样品中检te相应的动物i源、性成分;若再次扩增后无典型扣增l山线,则判定样品中未检LU相应的动物wl、性成分。923 对各种样品检测结果的判定,见表A.60 10 检测过程中防止交叉污染的措施防止污染的措施按GB/T27403的规定
14、执行。4 NY/T 3307-2018 附录A(规范性附录)实时荧光定性PCR号|物/探针序列、反应体系和结果判定A. 1 实时荧光定性PCR引物和探针序列见表A.10 表A.l实时荧光定性PCR号|物和探针序列引物探针名称缩写序列(5-3) 扩增片段,bp通用引物-上游UNF AAG!CG!GAAGACCC丁寸GGACTTTA228-241 通用引物-下游UNR GAT丁GCGCTGTTATCCCTAGGGTA内参引物上游16SF CCTAGCGATAACAGGGCATC 内参引物下iJff16SR 125 TT!AGCCTTGAACAAACGAACC 内参通用探制16SI 5CY5 -AC
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