NY∕T 3072-2017 禽结核病疹断技术(农业).pdf
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1、ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3072一2017禽结核病诊断技术Diagnostic techniques for avian tuberculosis 2017 -06- 12发布2017 - 10 -01实施中华人民共和国农业部发布目U吕本标准按照GB/T1. 1一2009给出的规则起草。本标准由农业部兽医局提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会CSAC/TC181)归口。本标准起草单位:中国兽医药品监察所。本标准主要起草人:朱良全、丁家波、蒋卉、毛开荣、彭小薇、王楠、徐磊、张磊。NY/ T 3072-2017 I NY/T 3072一201
2、7引禽结核病(a vian tu berculosis)是由禽分枝杆菌种禽型分枝杆菌亚种感染引起禽的一种慢性传染病。该病呈世界性分布,多呈散发性。该病血、鸡冠萎缩、破行以及产蛋减少明显的季节性和地区性。旦传人养禽场,则长类动物疫病。本标准报告。禽结或排泄物中分枝杆菌型分枝杆subsp. 片段主要用4个亚种中杆菌种、人/H 呼吸道感染,呈慢性经过,渐进性消瘦、贫因衰竭或肝破裂而突然死亡。无肉芽肿和干酷样结节。一疫技术规范国兽药典三部表的相关研究s)、林鸽15901基因分枝杆菌结核分枝NY / T 3072-2017 禽结核病诊断技术1 范围本标准规定了禽结核病临床诊断、病原分离与鉴定、病原核酸检
3、测及免疫学检测的诊断技术方法和试验程序。本标准适用于禽结核病的诊断、监测和检疫。皮内变态反应不适用于野鸡、火鸡、水禽等其他禽类。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 19489实验室生物安全通用要求3 缩略语下列缩略语适用于本文件。EDTA:乙二胶四乙酸Cethylenediamine tetraacetic acid)。IU:国际单位Cinternational units)。PCR:聚合酶链式反应Cpolymerasechain reaction)。
4、PPD:提纯蛋白衍生物、提纯结核菌素Cpurifiedprotein derivative)。4 生物安全要求在样品采集、样品处理、检测及废弃物处理过程中,应注意人员防护。其所涉及的实验操作,应按GB 19489的有关规定执行。5 临床诊断5. 1 临床症状以病禽消瘦、贫lI1、受侵器官组织结核性结节等为主要特征。病禽表现胸肌萎缩、胸骨突出或变形,冠、肉髦苍白。如果关节和骨髓发生结核,可见关节肿大、肢行;肺结核病禽可见呼吸困难;肠结核可引起严重腹泻。5. 2 病理变化5.2. 1 特征性病变在肠道、肝和脾上形成不规则的灰黄色或灰白色大小不等的结节,切开后可见结节外面有一层包膜,包有黄白色干酷样
5、物;不同大小的结节,有时融合成一个大的结节,在外观上呈瘤样轮廓。5. 2. 2 病理组织学检查发病初期,结节中心为变质性炎症,其周围被渗出物浸润,结节的外围是淋巴样细胞、上皮样细胞和朗罕氏多核巨细胞。当病程进一步发展,中心形成干酷样坏死。6 实验室诊断6. 1 细菌学检查l NY/T 3072-2017 6. 1. 1 仪器与耗材E级生物安全柜、恒温培养箱C400C420C)、冰箱C20C80C,-200C)、40C离心机、生物显微镜、剪刀、慑子、载玻片、接种环、染色盒等。6. 1.2 试剂6. 1. 2. 1 除特别规定外,所用化学试剂均为分析纯。6.1.2.2 4% HZS04榕液:配制方
6、法见附录A中的A.l。6.1.2.3 5% NaOH溶液:配制方法见A.2。6. 1. 2. 4 5 % HCl溶液:配制方法见6. 1. 2. 5 O . 1 %酣红指示剂:6. 1. 2. 6 甘油蛋白:配制6. 1. 2. 7 6. 1.3.1.2 用剪刀制成乳剂。指示剂,以2动物试验。6. 1. 3. 2 6. 1. 3. 2. 1 对病料为服状或干6. 1. 3. 2. 2 细菌培对于病变非典型落再镜检。其接种、培养、a) 接种。被检标本经消料,直接接种到配浆机匀浆,充分振摇5滴酣红作养和2. 2中d)J。如b) 培养。400C420C培养2周3周。茹剪霄军结核分枝杆菌,则形成湿润、
7、弥漫状、光滑及星状菌落。2 c) 涂片。先在玻片上涂布一层薄甘油蛋白,然后吸取标本l滴2滴加其上,涂布均匀。如检验标本为含脂肪较多的材料,在涂片制成后,可再加l滴2滴二甲苯或乙酷覆盖于涂片之上(以完全覆盖涂片为准)。经摇动1min2 min脱脂后倾去,再滴加95%酒精作用1min2 mm以除去二甲苯,待酒精挥发后即可染色。d) 妻一尼氏CZiehl-Neelsen)抗酸染色镜检。处理过的被检材料涂片后,经火焰固定,加苯酣复红染色液覆盖,将玻片在火焰上加热至出现蒸汽(不能产生气泡),如此热染5minC如染色液干酒,须加适量染液补充,以保持湿润)。水洗(用自来水清洗染色面,清洗时滴瓶头不要直接对N
8、Y/T 3072-2017 着染色面,而需要从侧面进行清洗未浸染的染料,防止将染色面洗掉。),然后滴加3%盐酸酒精脱色30s60 s(至无色素脱下为止。水洗后,以骆氏美蓝染色液复染1min。水洗(用自来水清洗染色面,清洗时滴瓶头不要直接对着染色面,而需要从侧面进行清洗未侵染的染料,防止将染色面洗掉。),吸干,镜检。6. l. 3. 3 结果判定禽结核分枝杆菌在显微镜下呈细长平直或微弯曲的杆菌,长1.5m5m,宽O.2mO. 5m。在陈旧培养基上,偶尔可见长达10m或更长的菌体。禽结核分枝杆菌应不被盐酸酒精脱色而染成红色,其他非结核分枝杆菌可被盐酸酒精脱色而被染成蓝色。6. 2 多重PCR6.
9、2. 1 仪器与耗材PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、恒温水浴箱、台式冷冻离心机(离心力可达15000g)、旋涡混匀器、冰箱(2.C8.C、一20.C、-80.C)、微量可调移液器(10L、100L、1000L)。6. 2. 2 试剂6.2. 2.1 2XPCR反应液含0.1U Taq Polymerase/L,dATP、dTTP、dCTP和dGTP各500mol/L,20mmol/L Tris-HCl (pH 8. 3) ,100 mmol/ L KC1, 3 mmol/ L MgClz.也可采用等效商品化试剂。6. 2. 2. 2 拧橡酸铀一磷酸缓冲液配制方法见附录C中的C.1。6.
10、2. 2. 3 PCR扩增基因名、引物序列及片段长度见表1。表1PCR扩增基因、引物序列及长度基因名引物序列53GAC寸CTACAAGGAGCTGGGDnaJ GAGACCGCCTTGAATCGTTC GAGTTGACCGCGTTCATCG 51245 CGTCGAGGAAGACATACGG GGA TTGCT AACCACGl飞GTG1S901 GCGAG寸GCTTGATGAGCG6.2.2. 4 灭菌二次蒸锢水6. 2. 2. 5 DNA标准M盯ker100 bp-1 kb) 6.2.2.6 电泳试剂扩增片段长度,bp140 385 577 Goldview或其他等效核酸染料,Tris乙酸
11、(TAE)电泳缓冲液,2%琼脂糖凝胶(配制方法见C.2)。6. 2. 3 试验方法及程序6. 2. 3. 1 样晶处理6. 2. 3. 1. 1 采样及样品前处理取适量肠道、肝或脾等病变组织样品(剔除脂肪、被膜),剪碎,按1: 5(W/V)的比例加人拧棱酸铀一磷酸缓冲液(例:1 g组织样品,加人5mL缓冲液),充分研磨;加等量4%NaOH溶液,继续研磨5 min 10 min,使组织液化;移人离心管,充分振荡,75.C温浴O.5 hl h;取上清液(避免吸取粗渣), 15000 g离心10min,弃上清液。沉淀加入与上清等量的0.01mol/L pH 7.6 PBS,充分悬浮并振荡混匀,150
12、00g离心10min,弃上清液,重复本步骤1次;收集沉淀物,进行核酸提取,或置一20.C储存备用。6. 2. 3. 1. 2 核酸提取3 NY/T 3072-2017 在上述已完成前处理的样品(沉淀物)中加人50L100LDNA提取液含100mmol/ L Tris-HCI(pH 8.0) ,0.01% TritonX -100,200g/L蛋白酶L与可采用等效商品化试剂,充分振荡混匀。56.C温浴30min, 98.C 100.C加热10min,瞬时离心。加等体积三氯甲:皖,振荡混匀,12000g离心5mln.取上清液,直接用于PCR或储存于-80.C备用。6. 2. 3. l. 3 灭活菌
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