核酸分析.pptx
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1、1 1 核核酸酸(Nucleic(Nucleic Acid)Acid)包包括括DNADNA和和RNARNA两两种种,是是由由碱碱基基、戊糖戊糖和和磷酸磷酸三者组成。三者组成。在在自自然然界界中中DNADNA分分子子存存在在形形式式有有:双双链链线线状状,双双链链闭闭环环,双双链链开开环环和和超超螺螺旋旋四四种种基基本本结结构构。不不同同结结构构的的DNADNA具具有有不不同同的的生生物物功功能能,但但绝绝大大多多数数DNADNA分分子子是是以以双双链超螺旋结构形式存在链超螺旋结构形式存在。DNADNA是是遗遗传传信信息息的的携携带带者者,是是基基因因表表达达的的物物质质基基础础,其其遗遗传传信
2、信息息是是通通过过不不同同核核苷苷酸酸的的排排列列顺顺序序而而被被贮存的。贮存的。2 2 与与DNADNA相相比比,RNARNA的的结结构构较较为为简简单单,它它主主要要是是以以单单链链形形式式存存在在,有有时时也也能能形形成成局局部部的的双双链链发发夹夹式式结结构构。它它的的一一般般功功能能是是翻翻译译,转转录录DNADNA分分子子所所含含的的信息,指导蛋白质的合成信息,指导蛋白质的合成。核核酸酸在在生生物物的的生生长长、发发育育和和繁繁殖殖等等正正常常生生命命活活动动中中起起着着非非常常重重要要的的作作用用。此此外外,核核酸酸与与生生命命的的异异常常现现象象(如如:肿肿瘤瘤)的的发发生生和
3、和遗遗传传性性疾疾病病等等紧紧密密关关联联。因因此此,核核酸酸是是现现代代生生物物学学、化化学学和和医医学学重重要的研究领域之一。要的研究领域之一。3 34.1.脱氧核糖核酸及核糖核酸的结构脱氧核糖核酸及核糖核酸的结构 核核酸酸是是由由大大量量的的核核苷苷酸酸单单体体以以聚聚合合方方式式组组成成的的极极长长的的线线状状聚聚合合物物。不不同同核核酸酸的的核核苷苷酸酸数数目目可可以以从从80(80(转移核糖核酸,转移核糖核酸,tRNA)tRNA)个碱基对大到个碱基对大到10108 8个碱基对。个碱基对。表表示示双双链链和和单单链链核核酸酸大大小小的的单单位位分分别别为为碱碱基基对对(bp(bp,b
4、asepare)basepare)和和碱碱基基(b(b,base)base),kbpkbp和和MbpMbp分分别别代代表表1 1 000000和和10000001000000个个碱碱基基对对,而而1kb1kb则则代代表表l l 000000个个碱碱基基。例例如如,噬噬菌菌体体染染色色体体的的大大小小为为4MbP4MbP,分分子子量量大大约约为为3lo3lo9 9,长长度度为为1.5mm1.5mm。DNADNA比比RNARNA大大得得多多,如如人人细细胞胞核核最最小小的的DNADNA分分子子中中碱碱基基对对数数目目为为4.5Mbp4.5Mbp,最最大的大的RNARNA分子仅含分子仅含50 kb5
5、0 kb,二者相差约,二者相差约10001000倍。倍。4 44.1.1 碱基、核苷及核苷酸碱基、核苷及核苷酸 核苷酸是核苷的磷酸酯,它们是脱氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)的组成单元。RNA的组成单元是核糖核苷酸,而DNA的组成单元是2脱氧核糖核苷酸。核酸中的五种主要碱基的结构核酸中的五种主要碱基的结构5 5由碱基和核糖结合所形成的-糖苷类化合物称为核苷。6 64.1.2 DNA的结构的结构DNA的一级结构 DNA由两条互补的单链DNA组成,每条单链都是脱氧核苷酸间以磷酸二酯键连接起来的,为了书写的方便,因常在描述DNA一级结构时可用一些简单的方式来表示。7 7如如左左图图DNA片片
6、段段,可可表表示示为为 5-dpApGpCpTpG-3,或或d(pAGCTG),式式中中的的d代代表表脱脱氧氧核核糖糖,p代代表表磷磷酸酸,当当p写写在在碱碱基基英英文文字字母母缩缩写写右右边边时时为为C3位位OH基基被被酯酯化化,写写在在左左边边时时为为C5位位OH基基被被酯酯化化。一一般般为为了了更更为为方方便便起起见见,就就简简单单地地写写为为AGCTG,其其方方向向规规定定为为53方向。方向。8 8DNA的二级结构 DNA的二级结构指DNA分子的空间结构,即三维空间的结构。1953年,Watson和Crick首先提出了DNA分子的双螺旋结构模型9 9DNADNA双螺旋结构模型及碱基配对
7、的示意图双螺旋结构模型及碱基配对的示意图1010 DNA的三级结构 DNA的三级结构是指双螺旋链的扭曲,包括多重螺旋、分子内单链形成的环等等。其中超螺旋是最常见的结构。一些病毒DNA是单股螺旋而绝大多数天然DNA是双股螺旋。不论是单股还是双股螺旋都可能形成闭环而失去自由的3和5末端。闭环分子大多数都会扭转成为三维螺旋结构,也就是DNA分子的三维结构,一般称作超螺旋(Supercoil or Superhelix)1111电镜下观察到的噬菌体电镜下观察到的噬菌体PM2PM2的超螺旋结构的超螺旋结构(a)(a)图为松弛环图为松弛环DNADNA,(b)(b)图为超螺旋图为超螺旋DNADNA12124
8、.2 核酸的定量及结构分析核酸的定量及结构分析 核酸是最重要的一类生物大分子,它与自然界中的各种生命活动都有着非常密切的关系。其含量的变化或结构的微小变化都可能导致意想不到的后果,如各种与基因相关的疾病的发生。可以说,该酸化学是现代分子生物学的主要研究内容。而所有这些研究工作都离不开核酸的分析问题,有时需要简单的定量,有时需要研究核酸结构的各种变化,等等。因此,核酸分析化学实际上是打开与核酸相关的各种难题的一把金钥匙,各种方法的研究具有重要的理论意义和实际应用价值。13134.2.1免疫化学法免疫化学法原理原理 有些构型的DNA(如左手螺旋DNA,Z-DNA)经化学修饰可以诱导产生高特异性的抗
9、体,所产生的抗体可以用作分析这些核酸的免疫化学试剂。免疫化学方法尤其适合于DNA结构及DNA化学修饰的分析,如DNA与致癌物所形成的加成物的分析。抗DNA抗体对于高特异性确定各种碱基及构型,检测不同构型DNA间的转化,及在复杂的细胞环境下DNA的化学修饰都是非常有用的。1414抗体制备 在实验中可采用两种免疫原来诱导单克隆或多克隆抗体。第一种免疫原是DNA与带正电荷的载体蛋白间所形成的非共价络合物,甲基化的牛血清白蛋白是常用的载体之一;另一种类型的免疫原是通过不同的方式将核酸组分(核苷酸、核苷或碱基)与载体蛋白共价连接而获得。除了实验免疫之外,动物或人的自身免疫疾病所产生的血清也可作为核酸抗体
10、的一种来源。1515分析方法 用于检测抗体与DNA复合物的方法包括凝胶免疫扩散法,沉淀法,絮凝法,络合物的电镜分析法,酶联免疫吸附分析法(ELISA)放射免疫分析法(RIA)和凝胶位移分析法等。16164.2.2 光谱法光谱法光谱方法可以分为下述三大类:(1)电子光谱:包括紫外(uv)及可见吸收光谱,荧光光谱,圆二色光谱(CD)及线圆二色(LD)光谱;(2)振动光谱:包括红外(IR)光谱,拉曼光谱及振动圆二色(VCD)光谱;(3)核磁共振(NMR)光谱。1717 产生上述三类光谱的来源不同,因而各类方法的灵敏度也就有很大的差别。一般来说,电子光谱的灵敏度比振动光谱或NMR光谱高12个数量级。也
11、就是说在使用振动光谱或NMR光谱时所需要的样品的浓度要比电子光谱时高12个数量级。另一方面,电子光谱不像振动光谱那样具有很强的特征性,当使用电子光谱时一般只利用了一种类型的生色基,如核酸碱基或其它类型的吸收配基面振动光谱可以提供核酸碱基及糖磷酸酯骨架的各种类型化学键的吸收。NMR光谱的分辨率也很高,特别是1H NMR和13C NMR,31P NMR光谱可以提供有关糖磷酸酯骨架的特殊信息。振动光谱及NMR技术可以提供更多的有关核酸分子状态及核酸分子不同部位变化的信息。1818紫外吸收光谱1.定量分析 20世纪60年代就发现了核苷酸、多聚核苷酸及核酸的紫外吸收。所有聚合态的核酸都在260 nm处有
12、一个宽的最大吸收带,230 nm处的吸收最小,在200nM以下的短波长区有另一最大吸收。吸光度比A260/A280和A260/A230是核酸质量的重要标准。纯核酸样品的A260/A280比值应该大于1.8;如果此值比较小则表示有蛋白质杂质的存在,因为蛋白质通常对280 nm处的吸收有很大的贡献。而比值A260/A230应该为2或更高此值低表示有蛋白质(肽键在此范围内有吸收)或其它杂质。另外,样品的悬浊性或乳光也会使这些比值产生比较大的偏差。1919 2吸收熔点曲线 当含有双螺旋DNA或RNA的水溶液的温度缓慢升高到某一温度时,由于解旋作用的发生,溶液的吸光度(一般在260 nm)会迅速增大。这
13、一转化过程突跃的中点所对应的温度称之为熔化温度Tm,与晶体的熔点对应。对链长较短的寡聚核苷酸,Tm或这种转化曲线的陡度随链的加长而增加,但Tm值在给定的条件下是固定值。DNA的Tm值与其所含的碱基(GC)或(AT)的相对含量之间的关系可用下述经验公式来表示:2020一些DNA的变性温度曲线曲线a、b和c所代表的DNA中(GC)分别为38、52和662121圆二色(CD)光谱 圆二色光谱是检测DNA构型变化的非常灵敏的技术。核酸的CD可用随波长的变化来表示,LR,L和R分别为用左手和右手圆极化光时的摩尔吸光系数。与核苷酸单体的CD相比,双螺旋核酸(DNA或双链RNA)具有强得多的CD吸收带。近紫
14、外区CD谱常被看成是不同类型双螺旋DNA的特征,持别适合于检测核酸双螺旋由右手B到左手Z型的转化。2222(a)Poly(dG-dC).poly(dG-dC)在在22 C下以下以B(-),A()和和Z型型()存在时的存在时的CD谱谱(b)Poly(rG-rC).poly(rG-rC)在以在以A型型(-)(22 C)和和Z型型()(46 C)存在时的存在时的CD谱谱2323 有许多化合物(如药物及染料)在可见或近UV区具有吸收,但由于不含手性中心而不具有CD信号,而当它们与DNA和RNA的螺旋结构结合时便会产生强的CD吸收带。这些吸收带有时在DNA的吸收带之外(通常大于300nm),在这种情况下
15、,值的大小可以用来指示药物与DNA和RNA的相互作用。比较有意义的例子是药物纺锤菌素(Netropsin)、远霉素(Distamycin)和DAPI4,6二脒基2苯基吲哚)与DNA小沟区的相互作用。2424拉曼光谱 现代激光拉曼光谱是研究核酸构型的强有力的工具。核酸拉曼光谱的范围大约为6001800 cm-1。从原理上讲,拉曼光谱可以显示类似于IR光谱的化学键的振动态。自20世纪80年代初期以来,振动拉曼光谱也被用于DNA构型变化的研究。通常采用对应于核酸碱基电子吸收(250280 nm)带的激发光激发。因此,只能观测到有关碱基构型变化的信息。振动拉曼光谱与常规拉曼光谱相比其优点是样品浓度可以
16、低20100倍,有时DNA构型发生变化时所引起的谱带强度的变化更大,检测比较容易。2525核磁共振光谱 NMR是目前用于DNA结构(构型)研究的特殊技术。31P NMR光谱已经被成功地用于推测磷酸二酯键的构型。研究表明,核苷酸之间磷酸酯的化学位移对O3P和PO5寡聚核苷酸骨架的扭转角非常敏感。2626 在核酸研究中光谱方法是应用最为广泛的物理方法,UV光谱以其简单(测定260 nm处的吸光度)而成为核酸研究实验室中用于测定DNA和RNA浓度的常规分析方法。其它光谱方法都需要特殊的仪器,这些仪器只有在专业性比较强的实验室里才有。要获得隐藏在DNA、RNA及寡聚核苷酸等样品光谱数据后面的所有信息则
17、需要特殊的训练和经验。CD,IR,拉曼,甚至NMR谱也可以用作定量及不同DNA构型比较的分析工具。可以跟踪构型的转化或配体的结合。有时根据转化和结合对温度的依赖性可以获得有关过程的热、动力学数据。2727NMR可用于合成的寡聚核苷酸或它们与蛋白质或配体所形成的络合物的研究,由此可以提供大量而重要的结构信息,特别是与计算机模拟计算结合使用时更是如此,所得结果可以与x射线晶体衍射所得的结果比较。28284.3 小分子与核酸相互作用的研究小分子与核酸相互作用的研究 在核酸化学研究中,小分子一般是指分子量不大于1000的一类有机化合物、络合物等,药物是这类化合物中典型的一类。这类小分子化合物一般属于癌
18、化学治疗试剂、核酸的裂解试剂、核酸染色及结构探针。因此,对它们的研究一直非常活跃。2929小分子与核酸相互作用研究受到重视的主要原因是:(1)研究结果表明,绝大多数抗癌药物在生物体内的靶目标都是DNA,它们通过与肿瘤细胞DNA结合,干扰DNA的复制和RNA的合成,使肿瘤细胞遭受致命损伤,因而药物与DNA作用的研究是药物作用机理研究的关键所在。这一领域的研究对于有效地设计和指导新药物的合成具有重要的意义。(2)广泛应用于分子生物学各个领域中的人工核酸内切酶是由小分子DNA裂解试剂和DNA识别结合系统组成的。由于这种内切酶能够在人们预先设计好的任何位点断裂DNA这就使其成为遗传工程技术中非常有用的
19、工具。(3)用作核酸探针的小分子可与某种特异的靶核酸分子发生明显的相互作用,从而可对核酸进行定量检测、序列和结构识别。3030 所以,小分子与核酸相互作用的研究,对于了解核酸的结构和功能,对于控制和改善基因表达,对于阐明药物的作用机理以及对于一些疾病的诊断、治疗均有着很重要的价值。31314.3.1 4.3.1 小分子与核酸的相互作用模式小分子与核酸的相互作用模式 小分子与核酸的相互作用可分为三种基本形式,即共价相互作用共价相互作用、可逆相互作用可逆相互作用及嵌入作嵌入作用用。3232共价作用共价作用 小分子与核酸的共价相互作用主要是同核酸各种碱基的反应,如亲核反应、亲电反应、加成反应等。目前
20、临床上使用的烷化剂类抗癌药物,它们可以使DNA的碱基烷基化,从而干扰DNA的复制和RNA的合成,因而表现为具有抗癌活性。目前最畅销的顺铂类抗癌药物具有极强的抗癌活性,这主要是由于发生鸟嘌呤N一7位亲电反应,形成了链内和链间交联物,结果大大干扰了DNA的双螺旋结构。3333 有许多致癌物在代谢过程中会转化为烷基化试剂而使DNA的碱基产生烷基化。在芳香族含氮化合物中最危险的一类是芳环羟氨类衍生物,它们在氨的生物氧化或含氮化合物的代谢还原过程中产生。偶氮类化合物的活化通过第一步还原和第二步氧化实现。在这些致癌物的活化过程中细胞色素C-P450(Cyt C-P450)常常起着非常重要的作用。实验结果表
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