SN∕T 3687-2013 桃X病植原体检疫鉴定方法(出入境检验检疫).pdf
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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3687-2013 桃X病植原体检疫鉴定方法Deecion and identification of peach X phyoplasma 2013-08-30发布2014-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局SN/T 3687-2013 目。昌本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本书Jll起草单位:中华人民共和作|湖北:1入境检验检疫局、华中农业大学、中华人民共和|王|辽宁:1人境检验检疫局O本标准主要起草人:冯汉利、王利平、王振华、洪霓、李金甫、赵晖、曾宪东、王有
2、福。SN/T 3687-2013 桃X病植原体检疫鉴定方法1 范围本标准规定了植物检疫中桃X病CPeach X disease)的现场检疫和分子生物学鉴定方法O本标准适用于进出境桃、油桃、樱桃、李树等种苗中桃X病植原体的检疫鉴定。2 桃X病植原体基本信息英文名:Peach X phytoplasma 分类地位:细菌界CBacteria),软壁菌门CTenericutes),柔膜菌纲CMollicutes) C又称软球菌纲),非固醇南原休日(Acholeplasmatales),非固醇菌原体科(Acholeplasmataceae),植原本属(问tcJlrna), 16Sr III植原体组O该植
3、原体的地理分布、寄主范围和症状、传播途径及基因组特征等参见附录A。3 方法原理DAPI染色后的形态学观察为初步筛查方法;以植原体核糖体16SrDNA通用引物进行PCR扩增、测序及限制性内切酶指纹图谱为主要的判定依据。4 主要仪器设备和用具4.1 仪器设备PCR仪、荧光显微镜、超净工作台、切片机、电泳仪、凝胶成象分析仪、冷冻离心机、电子天平(1/10 000 g)、超低温冰箱、常规冰箱、灭菌锅、pH计、水浴锅、振荡器等。4.2 用具可调移液器(0L 20 f-LL, 20 f-LL 200L、200L1 000 f-LL)、吸头、研钵、离心管(1.5mL、10 mL)、PCR管(0.2mL)、量
4、筒、烧杯、慑子等O5 主要试剂5.1 CTAB缓冲液CTAB Tris-HCl EDTA 氧化讷CNaCl)PVP 40 2% 100 mmol/L(pH 8.0) 20 mmol/LCpH 8.0) l.4 mol/L 1% SN/T 3687-2013 5.2 其他试剂DAPI染色液、液氮、MgC12,dNTP、TqDNA聚合酶、寻|物等O6 检疫鉴定方法6.1 症状检查观察桃、樱桃、油桃等种苗、果实、叶片等.症状描述参见附录A。6.2 样品的采集及制备取有疑似症状的植物的不同部位叶、枝等植物部分进行实验室检测鉴定。6.3 DAPI染色选取幼嫩组织(叶脉、侧芽),将叶柄和叶脉固定于5%戊二
5、醒缓冲液中,4oc保存备用Q制作切片,切片经0.1mol/L,磷酸缓冲液(pH7.0)冲洗3次;用1g/mLDAPI溶液染色10min 15 min,在460口m激发条件,荧光显微镜观察,在韧皮部筛管部位有明显的蓝色荧光信号表明有植原体存在。6.4 植原体形态观察对采集的植物样品制备超薄切片,通过透射电镜观察中直原体形态方法(见附录B)。6.5 植原体通用引物的Nested-PCR扩增、凝胶电泳及序列测定16Sr DNA的扩增使用果式PCR,第一次PCR扩I曾使用通J+FjI物为P1/P7,第二次PCR扩fti1采用通用引物R16F2n/R2;基于引物R16F2n/R2扩增的16SrDNA基因
6、的PCR产物凝胶电泳并经测序。具体操作见附录C。6.6 通用引物扩增产物的RFLP指纹图谱检测在6.5检测中,若经通用引物R16F2n/R16R2扩增所得到的序列通过软件进行RFLP图谱分析,具体操作见附录D。7 结果判定7.1 症状表现与A.3描述一致且DAPI染色观察结果显示蓝色荧光,可初步判定为植原体,但需通过6.5、6.6的方案进一步检测。7.2 在6.4检测中,电镜超薄切片在韧皮部筛管细胞中存在大量植原体,可初步判定该植物样品携带植原体,需要通过6.5、6.6的方案进一步检测O7.3 在6.5检测中,若通过通用P1/P7及R16日n/R2两对引物进行巢式PCR扩增,第二次扩增产物经凝
7、胶电泳检测结果为阳性,且R16F2n/R2扩增产物测序结果经比对,与C.4序列一致,则可判定该样品携带桃X州植!原体。7.4 在6.6检测中,通用引物R16F2日/R2扩增产物的RFLP分析片段大小与桃X植原体标准国语(见图D.l)相符,可判定该样品携带桃X病植原体。2 SN/T 3687-2013 8 样品保存8.1 样品保存与处理样品经登记和经于人签字后妥善保存。对检出桃X病植原体的样品应保存于-200C冰箱中,以备复核oi亥类样品保存期满后须经高压灭菌后方可处理O8.2 结果记录与资料保存J整的实验i己录包括样品的来源、种类、时间,实验的时|町、地点、方法和结果等,并要有实验人员和审核人
8、员签字。PCR疑胶电泳检测需有电泳结果照片。3 SN/T 3687-2013 附录A(资料性附录)桃X病植原体其他相关信息A.1 地理分布北美洲:加拿大(格雷特湖地区)、美国(1931年在加利福尼亚首次发现,现除了南卡罗来纳州、乔治亚州、阿肯色州和德克萨斯州外,几乎传遍整个美国),中国尚无报道。A.2 寄主范围桃树X病植原体可侵染大多数核果类果树,主要奇主植物包括李属植物如桃树(peach)、油桃( nectarine)、甜樱桃(sweetcherry)、李子(plur川、扁桃(almondtree)、杳(apricottree) ,及荷兰鸭儿芹(Cryttaenia ja如icaHassk)
9、。最近研究还表明许多果园中的杂草也可能是其寄主o经人工接种能感染芹菜。A.3 表现症状发病桃树最初的症状是形成黄色的病斑和卷叶,叶片黄化或红化,不规则水浸状斑点,通常沿着中脉向上卷曲。褪绿部分变干,变脆,坏死组织脱落,叶片破碎,穿孔,然后脱落,仅留一簇叶片在枝条的顶端(见图A.1和图A.2)。不久以后,整个植株出现褪绿,叶片脱落,只在枝条的顶部留下一些簇状叶片,幼树在发病后13年死亡,较成年的植株表现为慢性病症状。樱桃发病,果实上产生了小斑点而且不能成熟。X病植原体在美洲稠李上的典型症状在整个灌木上出现。叶片提前成熟,从亮黄到变红,在5月下旬或6月上旬脱落,植株节间大部分变短,稠李病株在表现症
10、状后一般13年内死亡。图A.1油桃表现桃X病害症状图A.2桃上表现桃X病害症状4 SN/T 3687-2013 A.4 传播途径在自然条件下,桃X病主要是由叶蝉介体传播和扩散,尤其是桃叶蝉CoLLadnusge1nznat川,且户hytliusacutus,深山叶蝉Colldnusmntanus和Pr户hlsz川zrrratuso在一定程度上,Fieberiella卢。而和Gr户hoce户hal(旷Zue川叶蝉也能传播。远距离以无症带茵茵木传播为主。A.5 基因组特征西方x-病植原体染色质DNA的246046bp序列,这段序列包括20个基因,其中19个基因己获得全长序列(l止ftingand
11、Kirkpatrick,2003)。d SN/T 3687-2013 B.1 试剂试材B. 1. 1 饿酸固定液a) 巴比妥乙酸饷缓冲液巴比妥饷2.89 g 乙酸的1.15 g 加双蒸水至100mL。b) 2%娥酸水溶液c) 1%饿酸固定液:巳比支乙酸讷缓冲液2%饿酸水溶液附录B(规范性附录)电子显微镜观察5.0 mL 12.5 mL 0. mol/L盐酸5.0 mL 力日双蒸水至25.0mLo 1昆合后用0.1mol/L盐酸调至pH为7.2,即为1%俄酸固定液,4oC保存备用。B.1.2 戊二醒固定液一般为25%戊二醒水溶液。可配制在除巳比妥以外任何缓冲液中使用,终浓度为25%0 B.1.3
12、 环氧树脂Epon 812 )1民I烯二酸西干(DDSA)邻苯二甲酸二I醋(D.B.P)5.0 mL 20.0 g 1.75 mL 二乙基苯胶CD.M.P-30)0.4 mL 将Epon812倒入烧杯中,置80oC温箱融化备用o按上述比例,顺序加入DDSA,充分搅拌,待融化呈透明,.-T:丰泪.再加入邻苯二甲酸二I四行,仔细搅拌,然后慢慢逐;而川人二乙某苯眩,边加边搅拌,-T:包埋齐IJ呈红棕色。B.1.4 Formvar膜将聚乙烯醇缩甲醒溶于三氯甲!院,配成0.2%3%溶液,存于冰箱备用。制膜时取一块干净玻璃片插入溶液中,取出倾斜待三氯甲炕挥发,用慑子沿玻璃边划痕,将玻璃倾斜人蒸饵水中,薄膜
13、即从玻璃片上脱落下来漂浮于水面,取干净的铜网摆上,压紧,再用一块滤纸覆盖其上,捞起后置于培养皿干燥备用。B.2 实验步骤B.2.1 取材选取呈现早期症状的桃X病植原体叶子,用刀片切成整齐的细条,大小为3mm20取健康桃叶做6 SN/T 3687-2013 对照。B.2.2 固定采用戊二醒饿酸双固定法G样品在25%戊二自主进行前固定2h后,PBS(0.2mol/L pH 7.4)清洗三次,然后用1%饿酸后固定2h,PBS清洁三次。B.2.3 脱水采用乙醇和系列梯度脱水。30%乙醇/15min50%乙醇/15min70%乙醇/15min80%丙醇/15 min90%丙酣/15min100%丙酣/1
14、5mi口。样品可在70%乙醇中停留过夜。B.2.4 渗透脱水后的组织块在丙酬/树脂中渗透3d,再在全树脂中渗透1do B.2.5 包埋用环氧树脂做包埋剂O将组织块放在胶囊中央,滴入包埋剂O于37oC下24h, 60 oC下24ho B.2.6 切片在超薄切片机上将固定的组织块作切片O选择好的切片,将切片用二甲苯蒸发展开,用载有Formvar膜的铜网捞起,置培养皿内干燥、保存OB.2.7 切片染色采用乙酸双氧铀和拧撮酸铅双染色。取染色蜡盘数个,将乙酸铀染液滴人蜡盘上O取带切片的铜网,插入染色滴中,染20min30 min,然后取出铜网,蒸榴水洗去多余染色液滤纸吸干O将铜网再放入另一蜡盘,滴人拧棱
15、酸铅染液,使铜网翻扣在染色液上,染20min30 min,再用0.1mol/L氢氧化的漂洗干净,滤纸吸干。B.2.8 显微镜观察透射电子显微镜观察植原体形态,如图B.1,引自(Guo.Y.H. Walla.J.A等1996)。7 SN/T 3687-2013 说明:A 韧皮部少量植原体;B 切J皮部大量植原体聚集;cw 细胞壁;M 植原体放大倍数:A,24,OOO;B,6,500X图B.1感染植原体病的美洲稠李叶柄交叉部电镜图8 SN/T 3687-2013 附录C(规范性附录)通用引物Nested-PCR扩增及测序C.1 DNA提取取大约0.2g叶组织(叶柄、叶脉、韧皮部),加入液氮在无菌研
16、钵中进行充分研磨,将粗汁液转移至2 mL离心管,4O(下4500 r/min离心5min。将悬浮液转至新的2mL离心管中。4O(下13 000 r/min离心15min,去掉上清液。加入1mL CTAB提取缓冲液;将离心管置于65O(水浴中温浴1h1.5 h,每隔20min左右将离心管颠倒混匀;2000 r/mi口,4O(离心2min;将离心后的上清转移至一个新的离心管中,加人氯仿/异戊醇(24/1)1mL,由匀,形成乳浊液;将乳浊液在13000 r/min,4 O( 离心5min;上清转入新管,加人800,uL预冷的异丙醇,13000 r/min,4 oc离心10min;弃上清,加人500
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