SN∕T 5201-2020 林麝物种鉴定技术规范(出入境检验检疫).pdf
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1、以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 52012020代替 SN/T 11622002林麝物种鉴定技术规范Protocol for species identification of moschus berezovskii中华人民共和国海关总署发 布ICS 65.020.01CCS B 432019-12-30 发布2021-07-01 实施以正式出版文本为准以正式出版文本为准ISN/T 52012020前 言本文件按照 GB/T 1.12020 的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中国检验检疫科学研究院、东北林业大学。本文件主要起草
2、人:吕继洲、吴绍强、林祥梅、袁向芬、王晓龙、王彩霞。 以正式出版文本为准以正式出版文本为准1SN/T 52012020林麝物种鉴定技术规范1范围本文件规定了林麝物种的形态学和 PCR 鉴定方法。本文件适用于林麝及其产品的物种鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB 19489实验室生物安全通用要求GB/T 27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语、定义和缩略语本文件没有
3、需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件。COI :细胞色素 c 氧化酶亚基 I(cytochrome c oxidase subunit 1) ;DNA :脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid) ;dNTP :脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate) ;PCR :聚合酶链式反应(polymerase chain reaction) ;SDS :十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate) 。4形态特征林麝典型形态特征见附录 A。5PCR 检测5.1仪器设备5.1.1常规 PCR 仪。5.1.2组织研磨器
4、。5.1.3超净工作台。5.1.4制冰机。5.1.5高速冷冻离心机。5.1.6水浴锅。5.1.7台式小型离心机。5.1.8常规冰箱。以正式出版文本为准2SN/T 520120205.1.9旋涡振荡器。5.1.10电泳仪。5.1.11凝胶成像系统。5.1.12微量可调移液器(10 L、100 L、1 000 L)及配套吸头。5.2试剂与材料5.2.1无水乙醇。5.2.2蛋白酶 K(20 mmol/L) 。5.2.350TAE 缓冲液(试剂配制见附录 B 中 B.1) 。5.2.4阳性对照(林麝的基因组 DNA) 。5.2.5Tirs-HCl 缓冲液(试剂配制见附录 B 中 B.3) 。5.2.6
5、生理盐水(试剂配制见附录 B 中 B.4) 。5.2.7EDTA 溶液(试剂配制见附录 B 中 B.5) 。5.2.8TES 缓冲液(试剂配制见附录 B 中 B.6) 。5.2.910% SDS 溶液(试剂配制见附录 B 中 B.7) 。5.2.10氯化钠。5.2.11三氯甲烷。5.2.12异丙醇。5.2.13冰乙酸。5.2.14Tris 饱和酚。5.2.1570% 乙醇。5.2.16Goldview 核酸染料。5.2.17Taq DNA 聚合酶。5.2.18dNTP(2.5 mmol/L) 。5.2.19琼脂糖。5.2.20灭菌双蒸水(应符合 GB/T 6682 中一级水的规格,见附录 B
6、中 B.8) 。5.3引物对MBF: 5 - CTTTCTTATTACTTCTAGCCTCC-3 (扩增林麝 COI 5端基因通用上游引物)MBR: 5 - ATACTGATCATACAAATAATGGA-3 (扩增林麝 COI 5端基因通用下游引物)用双蒸水将引物稀释为 20 mol/L 工作浓度,-20保存备用。除特别说明以外,本文件所用试剂均为分析纯,试验用水应符合 GB/T 6682 的规定。5.4检测方法5.4.1样品的处理5.4.1.1直接取新鲜的、冷藏的或冷冻的样品 200 L 用于核酸提取。5.4.1.2使用生理盐水洗去血污,取 100 mg200 mg 样品置于液氮中充分研磨
7、,将所研磨的粉末放入1.5 mL 的离心管中用于核酸提取。5.4.2样品 DNA 的提取采用以下方法提取 DNA,也可使用等效的商品化 DNA 提取试剂盒,按操作说明书进行操作。a)取 5.4.1 中处理好的样品,加入 450 L TES 缓冲液混匀后再加入 50 L SDS 溶液 (10%) ,5 L蛋白酶 K(20 mg/mL) ,充分混匀后,于 56 保温 4 h,每 2 h 摇 1 次。以正式出版文本为准3SN/T 52012020b)加入等体积的 Tris 饱和酚(500 L) ,混匀。c)取上层水相于新管,加入等体积的酚三氯甲烷异戊醇(25241) (试剂配制见附录 B中 B.9)
8、混匀,12 000 r/min 室温离心 5 min。d)取上层水相于新管,加入等体积的三氯甲烷混匀,12 000 r/min 室温离心 5 min。e)取上层水相,加入 2.5 倍体积的无水乙醇,混匀,置于 -20 2 h 以上或过夜,12 000 r/min 室温离心 15 min。f)弃上清液,加入 1 mL 预冷的 70% 乙醇,12 000 r/min 室温离心 5 min。g)吸弃残留液体,室温干燥 10 min 左右,用 50 L 灭菌双蒸水溶解,-20 保存备用。5.4.3PCR 扩增检测5.4.3.1PCR 反应体系10PCR 缓冲液 5.0 L dNTPs (2.5 mmo
9、l/L) 5.0 LMBF(20 pmol/L) 1.0 LMBR(20 pmol/L) 1.0 L样品 DNA 2.0 LTaq DNA 聚合酶 0.5 L灭菌双蒸水 35.5 L总体积为 50 L 体系,用漩涡混匀器进行混匀,瞬间离心,4备用。注: 也可使用其他商品化 PCR 扩增试剂盒,如 Promega GoTaq G2 DNA Polymerase 试剂盒。样品检测时,同时要设阳性对照和空白对照。阳性对照是已知的林麝提取的基因组 DNA(见附录 B.2) ,空白对照是灭菌双蒸水。5.4.3.2PCR 程序及反应条件反应参数为 95 1 min ;95 变性 30 s,48 退火 30
10、 s,72 延伸 1 min,38 个循环;然后 72 延伸 10 min,最后 4保存。注:没有热盖 PCR 仪器需加入矿物油 40 L。5.4.4PCR 产物的电泳检测用 TAE 电泳缓冲液配制 1% 琼脂糖凝胶板(Goldview 染料终浓度 0.5 g/mL) 。将平板放入水平电泳槽中,加入 1TAE 电泳缓冲液刚刚高出凝胶表面,将 PCR 扩增产物 5 L 和相应的上样缓冲液混合,分别加入样品孔中,电压 80 V100 V,电流 40 mA50 mA,电泳 30 min45 min。5.4.5凝胶成像系统观察扩增产物经电泳结束后,用凝胶成像仪观察检测结果、拍照,记录试验结果。5.5结
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