SN∕T 4656.7-2020 进出口纺织品生物安全检验方法 第7部分:铜绿假单胞菌(出入境检验检疫).pdf
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1、以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4656.72020进出口纺织品生物安全检验方法第 7 部分:铜绿假单胞菌Biosafety testing methods of the textiles for import and exportPart 7 :Pseudomonas aeruginosa2020-08-27 发布2021-03-01 实施ICS 59.080.99W 09中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准ISN/T 4656.72020前 言SN / T 4656进出口纺织品生物安全检验方法 ,共分为以下几个部分:第 1 部分:
2、白假丝酵母菌;第 2 部分:大肠埃希氏菌;第 3 部分:大肠菌群;第 4 部分:金黄色葡萄球菌;第 5 部分:菌落总数;第 6 部分:沙门氏菌;第 7 部分:铜绿假单胞菌;第 8 部分:通则本部分为 SN / T 4656 第 7 部分。本部分按照 GB / T 1.12009 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。本部分起草单位:中华人民共和国郑州海关、中华人民共和国石家庄海关。本部分主要起草人:李轲、郭会清、禹建鹰、郭华麟、连素梅、徐超、乔晴。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1SN/T 4
3、656.72020进出口纺织品生物安全检验方法 第 7 部分 : 铜绿假单胞菌1 范围SN / T 4656 的本部分规定了进出口纺织品中铜绿假单胞菌的检验方法。本部分适用于进出口纺织品铜绿假单胞菌的检验。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB / T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB / T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定SN / T 1538.1 培养基制备指南 第 1 部分:实验室培养基制备质量保证通则SN / T 1538.
4、2 培养基制备指南 第 2 部分:培养基性能测试实用指南SN / T 4656. 8 进出口纺织品生物安全检验方法 第 8 部分:通则3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 纺织品生物安全 biosafety of textiles纺织品中携带的有害生物本身或其代谢产物对生态环境和人体健康产生的潜在威胁,及对其所采取的一系列有效预防和控制措施。3.2 铜绿假单胞菌 pseudomonas aeruginosa也称绿脓杆菌,直或微弯革兰氏阴性、需氧、无芽孢杆菌,能够利用乙酰胺作为碳源,并分解乙酰胺产碱;能还原硝酸盐、液化明胶、在 42 条件下生长良好,具有致死率高、溶血性强、抗药性强等
5、特性。本菌在自然界分布广泛,主要的生长条件是潮湿环境,其它条件要求不高,可暂时寄生于皮肤,因此接触性体表感染率相当高。3.3 环介导恒温扩增 loop-mediated isothermal amplification;LAMP根据目标菌特有的靶序列保守基因设计的两对特殊的内、外引物,特异性识别靶序列上的六个独立区域,利用 Bst DNA 聚合酶启动循环链置换反应,在等温条件下保温 30 min 60 min 特异、高效、快速的完成核酸扩增。从 dNTP 析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的 Mg2+结合,产生副产物 (焦磷酸镁)形成乳白色沉淀,加入显色液,即可通过颜色变化观察判定结果。以正式出版
6、文本为准2SN/T 4656.720204 材料和设备4.1 无菌剪刀、镊子。4.2 电子天平:感量 0.01 g。4.3 无菌均质袋。4.4 拍击式均质器:400 mL。4.5 无菌规格板:20 cm2。4.6 无菌干燥棉拭子。4.7 微量移液器:量程 0.5 L 20 L,量程 100 L 1 000 L,量程 1 mL 10 mL。4.8 无菌小三角瓶:25 mL。4.9 无菌玻璃平皿或一次性无菌塑料平皿:15 mm90 mm。4.10 无菌 L 形玻璃捧。4.11 恒温培养箱:36 1 、42 1 。4.12 接种环。4.13 显微镜:10 100。4.14 全自动微生物生化鉴定系统。
7、4.15 灭菌离心管:1.5 mL。4.16 高速冷冻离心机:2 000 r / min 13 000 r / min。4.17 LAMP 反应管。4.18 水浴锅:65 1 。4.19 LAMP 实时浊度仪。5 培养基和试剂除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯;分子检测实验用水符合 GB / T 6682 中一级水的要求。5.1 无菌生理盐水:见 A.2。5.2 SCDLP 液体培养基:见 A.3。5.3 乙酰胺琼脂:见 A.4。5.4 革兰氏染色液:见 A.5。5.5 氧化酶试剂:见 A.6。5.6 硝酸盐蛋白胨水培养基:见 A.7。5.7 营养琼脂:见 A.8。5.8 灭菌双蒸水。5
8、.9 10LAMP 扩增缓冲液:含 200 mmol / L Tris- HCl(pH8.8) 、100 mmol / L 硫酸铵、500 mmol / L 氯化钾、20 mmol / L 硫酸镁、1% Tween20。5.10 引物:根据铜绿假单胞菌的 ETA 基因保守序列,设计一套 LAMP 特异性引物。外引物 F3 :5-TCTTCGGGCAGCTCCG-3外引物 B3 :5-TGGAGGTTGGCCGAACTC-3内引物 FIP :5-GCACATCCCGTGGTGCGTG-CAGCGGCGTGGGAGTT-3内引物 BIP :5-TGGAACGGGGTGGCTTGG-ATAGCGCC
9、CCGAAACCG-3环引物 LoopF :5-CAAGTGCCCGTATTGCGAC-3环引物 LoopB :5-ACGGCGGGGCGGGGTGGAG-3以正式出版文本为准3SN/T 4656.720205.11 100 mmol / L MgSO4。5.12 10 mmol / L 脱氧核苷三磷酸(dNTP)混合物:每种核苷酸浓度 10 mmol / L。5.13 Bst DNA 聚合酶 :8 U / L。5.14 显色液:SYBR Green I 染料,1 000。5.15 铜绿假单胞菌标准菌株。6 样品制备6.1 称量法无菌方法打开送检样品,用无菌剪刀(4.1)均匀剪样,在电子天平(
10、4.2)上准确称取剪下的样品 25 g,剪碎后加入到盛有 225 mL 无菌稀释液的无菌均质袋 (4.3) 中,用拍击式均质器 (4.4) 拍打 1 min 2 min,充分混匀,得到一个 1:10 的样品匀液。6.2 多点采样洗脱法无菌方法打开送检样品,在样品四周和中间均匀布控 5 个采样点,用无菌规格板(4.5)按每个采样点按 4 cm5 cm(20 cm2)面积范围剪裁,每 20 cm2采样面积为 1 份检样,每件样品共采集 5 份检样,采样面积为100 cm2。 将上述采集好的5份检样放入盛有200 mL无菌稀释液的无菌均质袋(4.3)中,用拍击式均质器 (4.4) 拍打 1 min
11、2 min,充分混匀,制成的样品匀液作为原液。6.3 棉拭子涂抹法无菌方法打开送检样品,用无菌稀释液湿润无菌干燥棉拭子(4.6) ,在样品四周和中间均匀布控5 个采样点,用无菌规格板(4.5)比照按每个采样点 20 cm2面积范围均匀涂抹,每个采样点用 1 个无菌干燥棉拭子(4.6) ,在 4 cm5 cm(20 cm2)面积范围均匀涂抹,立即用无菌剪刀(4.1)剪去棉拭子手接触部分,将涂抹部分一块放入盛有 50 mL 无菌稀释液的无菌均质袋(4.3)中混匀,制成 1:10的样品匀液。6.4 样品制备方法的选择6.4.1 样品制备一般依 6.1 方法为基准方法。6.4.2 当样品为面积较大或较
12、厚实或多孔时,样品制备应采用 6.2 方法。采用 6.2 方法时如果被检样品面积过大或过小,采样点可按比例增加或减少。6.4.3 当样品质地致密,不容易剪碎制备;或样品较贵重,客户要求无损检测的,样品制备应采用 6.3方法。6.4.4 采用 6.1、6.2 方法时如果被检样品大量吸水而导致不能吸出足够样品匀液转种时,稀释液可适当增加直至足够吸出转种。7 方法一 铜绿假单胞菌定量检验方法 平板计数法7.1 原理铜绿假单胞菌具有乙酰胺酶 , 能利用乙酰胺作为碳源,并分解乙酰胺产碱。样品接种乙酰胺培养基后,目标菌能使乙酞胺培养基变红;结合铜绿假单胞菌具有氧化酶阳性、能使硝酸盐还原产气和在42 生长的
13、特性,准确判定铜绿假单胞菌。7.2 检验程序检验程序见图 1。以正式出版文本为准4SN/T 4656.7202024 h2 h36 1 10 倍系列稀释按 6.1、6.2、6.3 制备的生理盐水样品匀液42生长试验无可疑菌落结果报告硝酸盐还原产气试验氧化酶试验染色观察选择 2 个3 个连续的适宜稀释度的样品匀液,接种乙酰胺琼脂平板挑取可疑菌落做确证试验图 1 铜绿假单胞菌平板计数检验程序7.3 操作步骤7.3.1 样品的稀释用微量移液器(4.7)移取制备好的样品匀液 1 mL ,缓慢注于盛有 9 mL 无菌生理盐水 (5.1) 的无菌小三角瓶(4.8)中(注意吸头尖端不要触及液面) ,振摇小三
14、角瓶或换用 1 支无菌吸头反复吹打使其混合均匀,制成下一稀释度的样品匀液。按照以上操作程序,制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释 1 次,换用 1 次无菌吸头。7.3.2 样品接种根据样品的实际污染情况,选择 2 个 3 个合适的稀释度样品匀液(包括原液) ,每个稀释度分别吸取 1 000 L 样品匀液以500 L、500 L 的接种量分别接种两块表面干燥的乙酰胺琼脂 (5.3) 平板,然后用无菌 L 形玻璃捧(4.10)均匀涂布整个平板,注意不要触及平板边缘。如样液不易吸收,可将平板放在 36 1 恒温培养箱(4.11)培养 1 h,等样品匀液吸收后翻转平皿,倒置于培养箱,培养 24
15、h2 h。7.3.3 典型或可疑菌落计数铜绿假单胞菌在乙酰胺琼脂(5.3)平板上菌落形态:乳白色扁平菌落,湿润,边缘整齐,菌落周围培养基颜色变红。挑选有典型或可疑铜绿假单胞菌菌落,且同一稀释度的两个平板所有典型或可疑菌落数合计在 20 CFU 200 CFU 范围内的平板,计数其典型或可疑菌落数。以正式出版文本为准5SN/T 4656.720207.3.4 确证试验7.3.4.1 概述从计数的乙酰胺琼脂(5.3)平板上至少挑取 5 个(少于 5 个则全部挑取)典型或可疑菌落,做如下确证试验。7.3.4.2 染色镜检挑取乙酰胺琼脂(5.3)平板上单个菌落,涂片,革兰氏染色液(5.4)染色,显微镜
16、(4.13)下观察其菌落形态。铜绿假单胞菌显微镜下为革兰氏阴性菌,细长且长短不一,有时呈球杆状或线状,成对或短链状排列。7.3.4.3 氧化酶试验取一张洁净滤纸放在灭菌玻璃平皿(4.9)内,用微量移液器(4.7)吸取氧化酶试剂(5.5)滴加一滴于滤纸上,仅使滤纸湿润,不可过湿,用接种环(4.12)挑取乙酰胺琼脂(5.3)平板上单个菌落涂在滤纸片上,在 10 s 内出现蓝色或蓝紫色者为阳性反应,不变色为阴性反应,铜绿假单胞菌氧化酶试验呈阳性反应。也可购买商品化氧化酶试剂或氧化酶试纸并按其说明书进行试验。7.3.4.4 硝酸盐还原产气试验挑取乙酰胺琼脂(5.3)平板上菌落,接种在硝酸盐蛋白胨水培养
17、基(5.6)中,36 1 培养 24 h2 h,观察结果,硝酸盐蛋白胨水培养基(5.6)内的小倒管中有气体者,即为阳性,否则为阴性。铜绿假单胞菌能还原硝酸盐,并将亚硝酸盐分解产生氮气,因此铜绿假单胞菌硝酸盐还原产气试验阳性。7.3.4.5 42 生长试验挑取乙酰胺琼脂(5.3)平板上菌落,划线接种在营养琼脂(5.7)培养基制成的斜面上,42 1 培养 48 h2 h,铜绿假单胞菌能 42 生长,为阳性,而近似的荧光假单胞菌则不能生长。如选择全自动微生物生化鉴定系统(4.14) ,可挑取乙酰胺琼脂(5.3)平板上可疑菌落接种营养琼脂(5.7)平板 36 1 培养 20 h2 h 进行纯化,挑取纯
18、化后的菌落制成一定浓度的菌悬液,使用全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。7.3.5 结果计算7.3.5.1 只有一个稀释度两个平板的典型或可疑菌落数合计在 20 CFU 200 CFU 之间,计数该稀释度两个平板上合计的典型或可疑菌落。7.3.5.2 最低稀释度两个平板的典型或可疑菌落数合计小于 20 CFU,计数该稀释度两个平板上合计的典型或可疑菌落。7.3.5.3 所有稀释度平板上的菌落数合计均大于 200 CFU 且有典型或可疑菌落,应计数最高稀释度两个平板上合计的典型或可疑菌落。以上典型或可疑菌落确证后按式(1)计算: (1)式中:T样品中铜绿假单胞菌菌落数;以正式出版文本为准6SN/T
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