SN∕T 5197-2019 牛结节疹病毒荧光定量PCR操作规程(出入境检验检疫).pdf
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1、以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 51972019牛结节疹病毒荧光定量 PCR 操作规程Quarantine protocol for real time PCR of lumpy skin disease virus2019-12-27 发布2020-07-01 实施ICS 65.020.01B 16中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准SN/T 51972019I前 言本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国重庆海关。本标准主要起草人:聂福平、李应国
2、、王昱、杨俊、王国民、李贤良、张雷、史梅梅、吴蕊。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1SN/T 51972019牛结节疹病毒荧光定量 PCR 操作规程1 范围本标准规定了牛结节疹病毒的荧光定量 PCR 检测方法。本标准适用于牛结节疹病毒核酸的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 19489 实验室 生物安全通用要求GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫GB/T 27403 实验室质量控制
3、规范 食品分子生物学检测3缩略语下列缩略语适用于本文件。Bp :碱基对(base pair)CPE :细胞病变效应法(cytopathic effect)Ct :每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数(cycle threshold)DNA :脱氧核糖核酸 (deoxyribonucleic acid)LSDV :牛结节疹病毒(lumpy skin disease virus)PBS :磷酸盐缓冲盐水 (phosphate buffered saline)PCR :聚合酶链反应 (polymerase chain reaction)Taq 酶:DNA 聚合酶 (TaqDNA po
4、lymerase)4原理采用 Taq Man 荧光定量 PCR 方法,通过比对牛结节疹病毒、山羊痘病毒和绵羊痘病毒的保守基因,针对 ITR 区域设计一对仅在牛结节疹病毒基因保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记 MGB 探针。探针的结合部位位于目的扩增片段内部。其中 5 端标记 FAM 荧光素为报告荧光基团(R) ,3 端标记的 MGB 荧光素(Q)在近距离内能吸收 5 端荧光基团发出的荧光信号,称为淬灭荧光基团。反应在退火时,引物和探针同时与目的基因片段结合,探针上 R 基团发出的荧光信号被 Q 基团所吸收,仪器检测不到荧光信号;而反应进行到延伸阶段时,Taq 酶发挥 53的外切核酸酶功能
5、,将探针降解。这样探针上的 R 基团游离出来,所发出的荧光不再为 Q 所吸收而被检测仪所接收。随着 PCR 反应的循环进行,PCR 产物与荧光信号的增长呈现对应关系。以正式出版文本为准2SN/T 519720195 设备和试剂5.1 主要仪器和设备5.1.1 荧光定量 PCR 仪。5.1.2 低温高速离心机、微量高速离心机。5.1.3 低温冰箱。5.1.4 微型振荡器。5.1.5 生物安全柜。5.1.6 恒温水浴锅。5.1.7 高压灭菌锅。5.1.8 微量可调移液器。5.2 试剂、耗材5.2.1 营养液:配制方法见 A.1。5.2.2 维持液:配制方法见 A.2。5.2.3 细胞分散液:配制方
6、法见 A.3。5.2.4 商品化微量病毒核酸提取试剂盒或其他商品化试剂盒。5.2.5 Premix Ex Taq(Probe qPCR)荧光 PCR 缓冲液。5.2.6 引物:根据牛结节疹病毒(LSDV)国际标准株基因序列,在其最保守的 ITR 区序列设计合成一对特异性引物,F: 5-TTGTCAGAAACGAGG-3,R: 5-ATGCCTCACTTGTATTTGG-3 和一条 MGB探针 (FAM)5-TCTTGCTAAAATACCA-3(MGB) 配制成 10 mol/L,-20 保存。注:以上所用的试剂和水,除特别注明者外均为分析纯试剂,水应符合 GB/T 6682 中规定的三级水的规
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