常规病理检查重点PPT课件.ppt
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1、常规组织病理学技常规组织病理学技术术固固 定定取取 材材脱水,透明,浸蜡脱水,透明,浸蜡包包 埋埋切片切片镜下观察,诊断镜下观察,诊断常规病理学技术(病理工作流程)常规病理学技术(病理工作流程)快速冰冻快速冰冻取材取材常规组织处理常规组织处理OCTOCT包埋包埋细胞学检查细胞学检查取材取材染色染色固定固定组织固定组织固定目的:目的:l保保持持组组织织和和细细胞胞的的形形态态学学特特征征,防防止止因因为为酶酶活活性性或或微微生生物物而而使组织坏死,自溶及腐败。使组织坏死,自溶及腐败。l保持组织和细胞中可溶性成分不被溶解。保持组织和细胞中可溶性成分不被溶解。l减少蛋白质、脂肪、糖、酶等细胞成分丢失
2、。减少蛋白质、脂肪、糖、酶等细胞成分丢失。l维持细胞膜,内质网,核膜等细胞结构的完整。维持细胞膜,内质网,核膜等细胞结构的完整。组织固定组织固定目的:目的:l使使组组织织中中的的各各种种物物质质沉沉淀淀和和凝凝固固起起来来,产产生生不不同同的的折折射射率率,造成光学上的差异,以便染色后易于鉴别和观察。造成光学上的差异,以便染色后易于鉴别和观察。l固定剂兼有硬化作用,使组织硬化增加组织硬度,便于制片。固定剂兼有硬化作用,使组织硬化增加组织硬度,便于制片。l防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。l经经过过固固定定的的组组织织,能能对对染染料料产产生
3、生不不同同的的亲亲和和力力而而着着色色清清晰晰,便于辩认。便于辩认。组织固定组织固定固定的机制和原理有很多种,包括固定的机制和原理有很多种,包括:l反应基团间的共价结合反应基团间的共价结合l交联的共价结合交联的共价结合l脱水与酸性物质作用脱水与酸性物质作用l盐的形成和热能盐的形成和热能l共同作用共同作用组织固定组织固定理想的固定剂:理想的固定剂:l保留蛋白,保留蛋白,mRNAmRNA以及以及DNADNA的生化特征。的生化特征。l支持组织化学染色,免疫组化,原位杂交和各种其他技术。支持组织化学染色,免疫组化,原位杂交和各种其他技术。l能快速渗透和固定组织。能快速渗透和固定组织。l适合各种不同的组
4、织和不同大小标本的固定。适合各种不同的组织和不同大小标本的固定。l固定剂易于回收和处理,价格合理。固定剂易于回收和处理,价格合理。l无毒,无害,无可燃性。无毒,无害,无可燃性。组织固定组织固定固定剂的种类:固定剂的种类:1 1、按照化学性质分类、按照化学性质分类l类类:醛醛类类:甲甲醛醛,戊戊二二醛醛,多多聚聚甲甲醛醛,丙丙烯烯醛醛,已已二二醛醛,丙二醛等。丙二醛等。l类类:氧氧化化剂剂类类:四四氧氧化化锇锇(奥奥酸酸),高高锰锰酸酸钾钾,重重铬铬酸酸钾等。钾等。l类:蛋白变性类:甲醇,乙醇,醋酸等类:蛋白变性类:甲醇,乙醇,醋酸等l类:其他:氯化汞,苦味酸等类:其他:氯化汞,苦味酸等。2 2
5、、按照成分分类:、按照成分分类:l单一固定液:如甲醛,酒精,醋酸,锇酸,丙酮等单一固定液:如甲醛,酒精,醋酸,锇酸,丙酮等l混合固定液:中性甲醛,混合固定液:中性甲醛,AFAF液等液等组织固定组织固定常用的固定方法常用的固定方法l蒸蒸汽汽固固定定法法:甲甲醛醛或或锇锇酸酸可可产产生生蒸蒸汽汽。用用于于保保存存可可溶溶性性成成分;小而薄的组织,冷冻干燥组织分;小而薄的组织,冷冻干燥组织l灌注固定法:肺,肾脏,肝脏等灌注固定法:肺,肾脏,肝脏等l细细胞胞涂涂片片的的固固定定:浸浸入入法法和和滴滴加加法法,浸浸入入法法应应注注意意相相互互污污染的问题染的问题l微微波波固固定定法法:微微波波加加热热可
6、可缩缩短短固固定定时时间间,但但时时间间和和温温度度掌掌握困难握困难常用固定液介绍常用固定液介绍甲醛(分子式甲醛(分子式:HCHO:HCHO)固定)固定:l纯甲醛是一种蒸汽纯甲醛是一种蒸汽l溶于水后成为溶于水后成为37%40%37%40%的甲醛溶液的甲醛溶液(又称福尔马林溶液)(又称福尔马林溶液)l固定液为固定液为10%10%的中性福尔马林(即的中性福尔马林(即约含约含4%W/V4%W/V的甲醛溶液)的甲醛溶液)l甲醛在水溶液中形成甲醛在水溶液中形成HOCH2OHHOCH2OH(亚(亚甲基氢氧化合物)复合物甲基氢氧化合物)复合物甲醛(分子式甲醛(分子式:HCHO:HCHO)固定)固定:l甲醛的
7、亚甲基氢氧化合物能与蛋白质末端多甲醛的亚甲基氢氧化合物能与蛋白质末端多种不同的功能基团结合,使蛋白多肽分子间种不同的功能基团结合,使蛋白多肽分子间形成桥键,使蛋白质不再发生改变,保存原形成桥键,使蛋白质不再发生改变,保存原位。位。-甲醛(分子式甲醛(分子式:HCHO:HCHO)固定的优点)固定的优点:l组织形态结构保存好组织形态结构保存好l固定均匀,穿透性强固定均匀,穿透性强l组织收缩少组织收缩少l增加组织硬度,便于切片增加组织硬度,便于切片l价格便宜价格便宜甲醛(分子式甲醛(分子式:HCHO:HCHO)固定的缺点)固定的缺点:l封闭抗原决定簇:封闭抗原决定簇:醛基与抗原蛋白氨基交联形成羧醛基
8、与抗原蛋白氨基交联形成羧甲基,使抗原决定簇的空间构象发生改变,甲基,使抗原决定簇的空间构象发生改变,可能部分和完全遮盖抗原决定簇,使之不可能部分和完全遮盖抗原决定簇,使之不能完全暴露,导致免疫组织化学染色产生能完全暴露,导致免疫组织化学染色产生假阴性。假阴性。处理措施:处理措施:固定后能够充分水洗,可减少分子间交联。固定后能够充分水洗,可减少分子间交联。抗原修复还可使抗原再现。抗原修复还可使抗原再现。缩短固定时间缩短固定时间(8(82424小时小时),降低固定温度,降低固定温度(4)(4)可减少交联。可减少交联。甲醛(分子式甲醛(分子式:HCHO:HCHO)固定的缺点)固定的缺点:l甲醛内杂质
9、含量多,影响酶染色甲醛内杂质含量多,影响酶染色l含甲酸,固定液酸化,影响染色含甲酸,固定液酸化,影响染色l产生甲醛颗粒,影响观察,尤以多血的肝,产生甲醛颗粒,影响观察,尤以多血的肝,脾组织常见脾组织常见l易挥发,污染环境易挥发,污染环境10%10%中性缓冲福尔马林固定液:中性缓冲福尔马林固定液:100ml40%100ml40%福尔马林福尔马林 900ml 900ml蒸馏水蒸馏水 NaH2PO4 4g NaH2PO4 4g Na2HPO4 6.5g Na2HPO4 6.5g最常用的固定液,抗原保存好,合适免疫组化染色。最常用的固定液,抗原保存好,合适免疫组化染色。常用甲醛固定液常用甲醛固定液优点
10、:优点:-保存组织中易溶于水的物质,如尿酸结晶和糖原保存组织中易溶于水的物质,如尿酸结晶和糖原-常与其他试剂配制成多种混合固定液:加快固定时兼有常与其他试剂配制成多种混合固定液:加快固定时兼有脱水的作用脱水的作用缺点:缺点:-可溶解脂类物质,要求保留脂类物质时不能使用酒精可溶解脂类物质,要求保留脂类物质时不能使用酒精-对组织收缩较大,单纯酒精固定组织收缩明显,变硬变对组织收缩较大,单纯酒精固定组织收缩明显,变硬变脆,制片困难脆,制片困难-渗透力差,组织表面已固定,组织中间固定不佳渗透力差,组织表面已固定,组织中间固定不佳-沉淀核蛋白,球蛋白,白蛋白,影响核染色沉淀核蛋白,球蛋白,白蛋白,影响核
11、染色-价格贵价格贵乙醇(乙醇(alcoholalcohol)固定)固定醋酸(醋酸(cetic acidcetic acid)固定)固定-对染色质固定较好。对染色质固定较好。-对脂肪、糖元不能固定。对脂肪、糖元不能固定。-能使组织膨胀,可抵偿因乙醇、升汞、甲醛等固定液引起的能使组织膨胀,可抵偿因乙醇、升汞、甲醛等固定液引起的组织收缩和硬化,故常配成组织收缩和硬化,故常配成5%5%混合固定液。混合固定液。-穿透速度最快,固定时间短。穿透速度最快,固定时间短。-5-5醋酸的醋酸的p p值在值在2828,此时可停止细菌和酶的活动,可防,此时可停止细菌和酶的活动,可防止组织自溶变性。止组织自溶变性。-能
12、沉淀蛋白质,它不能固定脂肪、类脂和糖类。能沉淀蛋白质,它不能固定脂肪、类脂和糖类。-穿透力较弱,单独使用可使组织收缩。多与醋酸和铬盐穿透力较弱,单独使用可使组织收缩。多与醋酸和铬盐(重铬酸钾)配成混合固定液。(重铬酸钾)配成混合固定液。-固定后细胞的结构,特别是核的细微结构显示清晰。固定后细胞的结构,特别是核的细微结构显示清晰。-易产生汞盐的沉着,损害切片刀,因此染色前必须脱汞。易产生汞盐的沉着,损害切片刀,因此染色前必须脱汞。氯化汞(氯化汞(ercury bichlorideercury bichloride)-能沉淀蛋白质,但对脂肪和类脂无固定作用。能沉淀蛋白质,但对脂肪和类脂无固定作用。
13、-穿透力很慢,细胞收缩显著,但不会使组织硬化。穿透力很慢,细胞收缩显著,但不会使组织硬化。-有软化皮肤的作用,配制的有软化皮肤的作用,配制的BouinBouin氏液对头皮及全身皮肤制氏液对头皮及全身皮肤制片效果甚好。片效果甚好。-固定时间太久会影响固定时间太久会影响HEHE染色。染色。-糖元较好的固定剂。糖元较好的固定剂。苦味酸(苦味酸(icric acidicric acid)-可以作固定剂,又可作脱水剂,穿透速度快,可使蛋白可以作固定剂,又可作脱水剂,穿透速度快,可使蛋白质沉淀凝固,质沉淀凝固,2 2毫米以下的组织固定半小时至毫米以下的组织固定半小时至1 1小时即可。小时即可。-可引起组织
14、较强的收缩使之变硬,对核固定不佳。可引起组织较强的收缩使之变硬,对核固定不佳。-对某些酶的固定很好,如碱性磷酸酶、酸性磷酸酶等。对某些酶的固定很好,如碱性磷酸酶、酸性磷酸酶等。-一般多与氯化汞、甲醛混合液使用,先用低浓度丙酮再一般多与氯化汞、甲醛混合液使用,先用低浓度丙酮再经高浓度丙酮固定以减少组织收缩和过度硬化。经高浓度丙酮固定以减少组织收缩和过度硬化。丙酮丙酮-强氧化剂,不能与酒精等还原剂混合,常配成强氧化剂,不能与酒精等还原剂混合,常配成0.5%0.5%水溶水溶液固定组织。液固定组织。-单独固定组织不能沉淀蛋白质,但加入冰醋酸转变为铬单独固定组织不能沉淀蛋白质,但加入冰醋酸转变为铬酸,(
15、即酸化重铬酸钾),可使蛋白质凝固沉淀。酸,(即酸化重铬酸钾),可使蛋白质凝固沉淀。-与甲醛混合是固定线粒体、高尔基复合体和嗜铬细胞等与甲醛混合是固定线粒体、高尔基复合体和嗜铬细胞等优良固定剂,若配成优良固定剂,若配成EenkerEenker氏液,能很好的固定细胞质、氏液,能很好的固定细胞质、胞核及染色体。胞核及染色体。-穿透速度快,组织收缩小,固定的组织必须流水充分洗穿透速度快,组织收缩小,固定的组织必须流水充分洗涤(涤(6 612h12h),否则影响染色。),否则影响染色。对酸性染料染色良好,对碱性料染较差,若加入升汞及醋对酸性染料染色良好,对碱性料染较差,若加入升汞及醋酸等,则对细胞核染色
16、极佳。酸等,则对细胞核染色极佳。重铬酸钾重铬酸钾乙醇乙醇-甲醛液(甲醛液(AFAF液)液)配制:配制:95%95%或无水乙醇或无水乙醇90ml90ml加入加入40%40%瓶装甲醛瓶装甲醛10ml10ml,常用固定液。,常用固定液。兼有脱水作用,用于固定肥大细胞和糖元较兼有脱水作用,用于固定肥大细胞和糖元较好,米粒大小固定好,米粒大小固定4 46h6h,大块组织,大块组织121224h24h,固,固定后不经水洗,直接放入定后不经水洗,直接放入95%95%酒精开始脱水。酒精开始脱水。enkerenker氏液氏液配制配制:重铬酸钾重铬酸钾2.5g+2.5g+升汞升汞5g+5g+蒸馏水蒸馏水100ml
17、100ml,加温溶解,加温溶解,冷却过滤,贮于棕色瓶内,成为贮存液。冷却过滤,贮于棕色瓶内,成为贮存液。用时取此液用时取此液95ml95ml再加入冰醋酸再加入冰醋酸5ml5ml即成。即成。enkerenker氏液固定后,细胞核和细胞浆染色较为氏液固定后,细胞核和细胞浆染色较为清晰,特别显示骨骼肌的横纹清晰,特别显示骨骼肌的横纹 固定时间固定时间12-24h12-24h,然后冲洗,然后冲洗24h24h,切片脱腊后,切片脱腊后需脱汞(浸入需脱汞(浸入5%5%碘酒精碘酒精1010),脱碘(),脱碘(5%5%硫代硫酸钠)硫代硫酸钠)流水洗。流水洗。BouinBouin氏液氏液配制:苦味酸饱和液配制:苦
18、味酸饱和液75ml+75ml+甲醛甲醛25ml+25ml+冰醋酸冰醋酸5ml5ml 此液渗透快,组织收缩小,固定均匀,为常用固此液渗透快,组织收缩小,固定均匀,为常用固定液。它对肝、皮肤、胰脏特染效果好,但固定定液。它对肝、皮肤、胰脏特染效果好,但固定过久对碱性染料的着色有影响。过久对碱性染料的着色有影响。GarnayGarnay氏液氏液配制:纯酒精配制:纯酒精60ml+60ml+氯仿氯仿30ml+30ml+醋酸醋酸10ml10ml细胞极好的固定液,对淋巴组织及腺体固定很好,细胞极好的固定液,对淋巴组织及腺体固定很好,米粒大的组织固定米粒大的组织固定1 12h2h,也适宜,也适宜RNARNA、
19、DNADNA及糖元的及糖元的固定。固定。HellyHelly氏液氏液配制:重铬酸钾配制:重铬酸钾25g+25g+升汞升汞50g+50g+蒸馏水蒸馏水1000ml+1000ml+甲醛甲醛50ml50ml白细胞颗粒良好的固定剂,可用于造血器官,如骨白细胞颗粒良好的固定剂,可用于造血器官,如骨髓,脾脏的固定。髓,脾脏的固定。B5B5固定液固定液配制:储备液:氯化汞配制:储备液:氯化汞12g+12g+醋酸钠醋酸钠2.5g+2.5g+蒸馏水蒸馏水200ml200ml。使用前加。使用前加2ml2ml甲醛到甲醛到20ml20ml储备液中储备液中常用于骨髓,淋巴结,脾和其他造血组织的固定。常用于骨髓,淋巴结,
20、脾和其他造血组织的固定。组织固定注意事项组织固定注意事项l组织离体后尽早放入固定液中组织离体后尽早放入固定液中l固定液体的体积应大于标本的固定液体的体积应大于标本的4545倍,甚至倍,甚至2020倍倍l固定的容器口要方便组织固定后取出固定的容器口要方便组织固定后取出l组织固定时间不宜太长,一般不超过组织固定时间不宜太长,一般不超过7272小时,固定小时,固定不足和固定时间太久都可能影响染色,免疫组化等不足和固定时间太久都可能影响染色,免疫组化等组织取材组织取材l尸检组织取材尸检组织取材l外科切除标本取材外科切除标本取材l活检小组织取材活检小组织取材组织取材组织取材要求:要求:l取材组织厚度小于
21、取材组织厚度小于3mm3mm,长度和宽度大约,长度和宽度大约2cm2cm为宜。为宜。l取材刀锋利,避免组织损伤。取材刀锋利,避免组织损伤。l剔除标本中的线头,吻合钉。剔除标本中的线头,吻合钉。l有钙化和骨化的组织要脱钙。有钙化和骨化的组织要脱钙。l保持取材台的干净,流水冲洗。保持取材台的干净,流水冲洗。l避免小标本丢失,可用伊红染料标记。避免小标本丢失,可用伊红染料标记。l肿瘤标本取材应注意相互关系。肿瘤标本取材应注意相互关系。l核对标本,以免张冠李戴核对标本,以免张冠李戴组织处理组织处理1 1、脱水:、脱水:将将组组织织内内的的水水分分用用某某些些化化学学试试剂剂置置换换出出来来的的过程称脱
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