动物性食品中致病微生物和寄生虫的检验检疫.ppt
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1、动物性食品中致病微生物和寄生虫的检验检疫主要内容主要内容动物性食品中菌落总数与大肠菌群的检验动物性食品中致病菌的检验动物性食品中致病性病毒的检验动物性食品中致病性寄生虫的检验食源性疾病是世界各国面临的主要公共卫生问题之一,即便是在欧美发达国家,患食源性疾中的人群可高达30%。污染食物对人类健康构成威胁的主要因子包括化学性和生物性两大类,前者如兽药、农药和重金属,后者包括细菌、真菌及其毒素、病毒等。根据美国疾病预防与控制中心统计,在20世纪90年代由各种原因引起的食源性疾病中,细菌性占90%,化学性仅占3%。根根据据国国家家食食源源性性疾疾病病监监测测网网部部分分资资料料的的分分析析结结果果显显
2、示示,我我国国食食源源性性疾疾病病的的高高危危食食品品依依次次为为肉肉类类、粮粮食食、海海产产品品、水水果果蔬蔬菜菜、鸡鸡蛋蛋、豆豆类类、奶奶。由由动动物物或或植植物物性性食食物物污污染染所所引引起起的的疫疫病病比比例例接接近近(约约各各占占30%30%),而而其其中中因因微微生生物物污污染染引引起起的的食食源源性性疾疾病病比比例例接接近近40%40%,远远高高于于化化学学性性食食物物中中毒毒(20%20%)。综综观观国国内内外外食食源源性性疾疾病病的的发发病病情情况况,动动物物性性食食品品中中微微生生物物污污染染是是人类食源性疾病的主要问题。人类食源性疾病的主要问题。2014年2月19日,国
3、家食品安全风险评估中心,牵头起草的食品中致病菌限量标准,将自2014年7月1日起实施。该标准对肉制品、水产制品、粮食制品、即食果蔬制品、饮料等11大类食品分别制定了沙门氏菌等5种致病菌的限量规定,可基本满足我国食品中致病菌的控制需求,适应我国食品安全的监管需要。动物性食品易被微生物污染的原因1 食品基质 水分、丰富的营养物质2 食品的酸性3 环境条件:温度、气体、湿度动物性食品中微生物污染的可能途径主要有:动物性食品中微生物污染的可能途径主要有:食品原料本身的污染;食品原料本身的污染;动物养殖环境中的微生物对食品原料的污染;动物养殖环境中的微生物对食品原料的污染;屠宰过程中的污染;屠宰过程中的
4、污染;深加工动物食品可能受到加工车间、加工设备表面残存微深加工动物食品可能受到加工车间、加工设备表面残存微生物污染;生物污染;食品从加工出厂、贮存、运输、销售过程中可以受到相应食品从加工出厂、贮存、运输、销售过程中可以受到相应环境中微生物的污染;环境中微生物的污染;在家庭、宾馆等厨房中生熟食品的交叉污染。在家庭、宾馆等厨房中生熟食品的交叉污染。食品微生物检测所涉及的类群食品微生物检测所涉及的类群微生物非细胞生物细胞生物病毒原核生物真核生物细菌酵母菌、霉菌 微生物检测程序微生物检测程序 样品的采集样品的采集注意:注意:1 所用接触样品的用具经过所用接触样品的用具经过灭菌灭菌 2 取样要均匀、特殊
5、样品要取样要均匀、特殊样品要控制温度控制温度 3 样品采好后要贴上标签样品采好后要贴上标签(注明:样品名称、来源、(注明:样品名称、来源、数量、采样人、地点及时数量、采样人、地点及时间)间)样品的微生物检验样品的微生物检验注意:注意:1 采好的样品送检不采好的样品送检不要超过要超过3小时小时2 检完的样品的存放检完的样品的存放时间时间 3 报告的填写报告的填写 微生物对食品的污染问题是我国乃至全世微生物对食品的污染问题是我国乃至全世界食品安全中最突出的问题,我国为此数次颁界食品安全中最突出的问题,我国为此数次颁布食品微生物检验标准。按照食品安全国家标布食品微生物检验标准。按照食品安全国家标准要
6、求,准要求,菌落总数和大肠菌群菌落总数和大肠菌群是食品企业出厂是食品企业出厂时必检的微生物指标。时必检的微生物指标。菌落总数菌落总数是指一定培养条件下(如需氧状况、培养基成是指一定培养条件下(如需氧状况、培养基成分、分、PH、培养温度和时间等)每克(每毫升)食品样品中所、培养温度和时间等)每克(每毫升)食品样品中所生长出来的细菌菌落总数。生长出来的细菌菌落总数。检测菌落总数,检测菌落总数,可以判定食品被细菌污染可以判定食品被细菌污染程度,反映出食品的新鲜程度和卫生状况程度,反映出食品的新鲜程度和卫生状况。如果某食品的菌落总数严重超标,说明其产如果某食品的菌落总数严重超标,说明其产品的卫生状况达
7、不到基本的卫生要求,食品品的卫生状况达不到基本的卫生要求,食品将加速腐败变质,失去食用价值。将加速腐败变质,失去食用价值。小型企业,原料控制,加工车间控制不严小型企业,原料控制,加工车间控制不严第一节第一节 动物性食品中菌落总数与大肠菌群的检验动物性食品中菌落总数与大肠菌群的检验 菌落总数的检验程序菌落总数的检验程序25g(ml)样品+225ml生理盐水(1:10的稀释液)作几个适当倍数的稀释液(例如1:100,1:1000)选择23个适宜稀释度各取1ml分别加入灭菌培养皿中每个平皿中加适量(1520ml)营养琼脂菌落记数 注意事项:注意事项:1 操作要在无菌的状态下进行。操作要在无菌的状态下
8、进行。2 操作时间越短越好。操作时间越短越好。3 样品不同选择的稀释倍数不同。样品不同选择的稀释倍数不同。4 培养基冷却温度不宜过高或过低。培养基冷却温度不宜过高或过低。大肠菌群系指一群能发酵乳大肠菌群系指一群能发酵乳糖、需氧和兼性厌氧的革兰糖、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌,包括肠氏阴性无芽孢杆菌,包括肠杆菌科的大肠埃希氏菌属、柠檬杆菌属、肠杆菌属和克杆菌科的大肠埃希氏菌属、柠檬杆菌属、肠杆菌属和克雷伯菌属细菌。雷伯菌属细菌。检测大肠菌群,检测大肠菌群,可以判定食品被与粪便污染有关的细菌可以判定食品被与粪便污染有关的细菌污染的程度。污染的程度。如果某食品的大肠菌群超标,则可以推测其产如
9、果某食品的大肠菌群超标,则可以推测其产品中存在着肠道致病菌污染的可能性,食用之可能导致食物品中存在着肠道致病菌污染的可能性,食用之可能导致食物中毒或罹患流行病。中毒或罹患流行病。第二节第二节 动物性食品中致病性细菌的检验动物性食品中致病性细菌的检验沙门氏菌沙门氏菌致病性大肠杆菌致病性大肠杆菌副溶血弧菌副溶血弧菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌溶血性链球菌溶血性链球菌产单核细胞李斯特菌产单核细胞李斯特菌肉毒梭菌肉毒梭菌结核分枝杆菌结核分枝杆菌空肠弯曲杆菌空肠弯曲杆菌炭疽杆菌炭疽杆菌产气荚膜梭菌产气荚膜梭菌蜡样芽孢杆菌蜡样芽孢杆菌变形杆菌变形杆菌动物性食品中沙门氏菌的检验动物性食品中沙门氏菌的检验一、
10、教学目的一、教学目的1 1、掌握食品中沙门氏菌的检验原理。、掌握食品中沙门氏菌的检验原理。2 2、掌握食品中沙门氏菌的检验方法。、掌握食品中沙门氏菌的检验方法。1885年沙门氏等在霍乱流行时分离到猪霍乱沙门氏菌,故定名为沙门氏菌属。沙门氏菌属有的专对人类致病,有的只对动物致病,也有对人和动物都致病。沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式的总称。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品,可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中,沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位 二、实验原理二、实验原理(一)沙门氏菌属简介(一)沙门氏
11、菌属简介沙门氏菌属是一群符合肠杆菌科定义并与其血清学相关的沙门氏菌属是一群符合肠杆菌科定义并与其血清学相关的革兰氏阴性、需氧性、无芽孢杆菌。本菌属种类繁多,抗革兰氏阴性、需氧性、无芽孢杆菌。本菌属种类繁多,抗原结构复杂,现已发现原结构复杂,现已发现20002000多个血清型,我国已发现血清多个血清型,我国已发现血清型近型近200200个。个。沙门氏菌在水中不易繁殖,但可生存沙门氏菌在水中不易繁殖,但可生存2-32-3周,周,冰箱中可生冰箱中可生存存3-43-4个月个月,在自然环境的粪便中可存活,在自然环境的粪便中可存活1-21-2个月。沙门氏个月。沙门氏菌最适繁殖温度为菌最适繁殖温度为3737
12、,在,在2020以上即能大量繁殖,因此,以上即能大量繁殖,因此,低温储存低温储存食品是一项重要预防措施。食品是一项重要预防措施。沙门氏菌属沙门氏菌属生物学特性生物学特性形态特征:形态特征:革革 兰兰 氏氏 阴阴 性性,大大 小小 为为 1-1-3 30.4-0.9m0.4-0.9m的的两两端端钝钝圆圆的的短短杆杆菌菌,无无芽芽孢孢,一一般般无无荚荚膜膜,除除鸡鸡沙沙门门氏氏菌菌和和雏雏沙沙门门氏氏菌菌以以外外,都都有有周周身身鞭鞭毛毛,运动力强。运动力强。培养特性:培养特性:沙门氏菌沙门氏菌需氧或兼性厌氧需氧或兼性厌氧,10104242都可生长,最适生长都可生长,最适生长温度为温度为3737,
13、最适,最适pHpH为为6.86.87.87.8。营养琼脂平板上:营养琼脂平板上:35353737培养培养18-24h18-24h,其菌落大小一般,其菌落大小一般为为2 23mm3mm,光滑、湿润、无色、半透明、边缘整齐。,光滑、湿润、无色、半透明、边缘整齐。血平板上:中等大小的灰白色菌落。血平板上:中等大小的灰白色菌落。生化特性:生化特性:l l绝大多数沙门氏菌有规律的发酵葡萄糖产酸产气,但也有不产气绝大多数沙门氏菌有规律的发酵葡萄糖产酸产气,但也有不产气者,不发酵蔗糖和侧金盏花醇、不产生吲哚、不分解尿素。者,不发酵蔗糖和侧金盏花醇、不产生吲哚、不分解尿素。沙门氏菌属沙门氏菌属致病性致病性v沙
14、门氏菌胃肠炎是由除伤寒沙门氏菌外任何一型沙门氏菌而所致,潜伏期一般6-72小时,主要症状为恶心、呕吐、腹绞痛、腹泻、发热寒颤头痛。病程一般12天或更长。感染剂量为1520个菌,死亡率达14%。最易感群体是年幼儿童、虚弱者、年长老人、免疫缺陷者等。v污染源主要是人和家畜的粪便,沙门氏菌常存在于动物中,特别是禽类和猪。在许多环境中也有存在。从水,土壤,昆虫中,从工厂和厨房设施的表面和动物粪便中已发现该类细菌。它们可以存在于多类食品中,包括生肉,禽,奶制品和蛋,鱼,虾和田鸡腿,酵母,椰子,酱油和沙拉调料,蛋糕粉,奶油夹心甜点,顶端配料,干明胶,花生露,橙汁,可可和巧克力。传播途径传播途径肉的污染肉的
15、污染肉及其制品的沙门氏菌检出率美国为20%25%、英国为9.9%、日本检查进口家禽的污染率为10.3%,国内肉类沙门氏菌检出率在1.1%39.5%。蛋的污染蛋的污染中国蛋及其制品沙门氏菌检出率为3.9%-43.7%,由于吃蛋引起鼠伤寒病的病例报告逐渐有增加的趋势。环境污染环境污染食品在加工、运输、出售过程中往往被沙门氏菌污染。沙门氏菌在粪便、土壤、食品、水中可生存5个月至2年之久。2013年6月10日,广东东莞某工厂爆发大规模的员工食物中毒事件,100多名员工出现发冷、高热、恶心、呕吐、腹痛、腹泻等不适症状;13日,四川眉山市一所学校386人陆续出现发烧、腹泻、呕吐症状入院救治;15日,广州经
16、济技术开发区一家包装厂76名夜班工人纷纷出现上吐下泻和发烧症状。实验证明,沙门氏菌中毒的原因大多是因为食前未加热处理或加热不彻底。其实,沙门氏菌属在100时立即死亡,70经5分种,65经1520分钟,60经1小时可被杀死。2011-08-05,美国最大的肉类加工巨头嘉吉公司3日晚召回3600万磅,即大约1.63万吨火鸡肉。这为美国史上最大规模的召回事件。目前,美国26个州已有77人感染沙门氏菌,其中一人死亡。不过,美国多名政府官员介绍,即使确认火鸡肉受沙门氏菌污染,只要烹饪达到74摄氏度,仍可放心食用。(二)检验(二)检验 GB/T 4789.4-20031.1.前增菌前增菌:第一步使食物样品
17、在含有营养的非选择性培养基中第一步使食物样品在含有营养的非选择性培养基中(缓冲蛋白胨水)缓冲蛋白胨水)增菌,使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。增菌,使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。2.2.选择性增菌选择性增菌:在含选择性抑制剂的促生长培养基中间,样品进一步增菌的一在含选择性抑制剂的促生长培养基中间,样品进一步增菌的一个步骤。此培养基允许沙门氏菌持续增殖,同时阻止大多数其他细菌的增殖。个步骤。此培养基允许沙门氏菌持续增殖,同时阻止大多数其他细菌的增殖。3.3.选择性平板分离选择性平板分离:这一步采用固体选择性培养基,抑制非沙门氏菌的生长,这一步采用固体选择性培养基,抑制非沙
18、门氏菌的生长,提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。4.4.生物化学筛选生物化学筛选:排除大多数非沙门氏菌。也提供了沙门氏菌培养物菌属的初排除大多数非沙门氏菌。也提供了沙门氏菌培养物菌属的初步鉴定。步鉴定。5.5.血清学技术提供了培养物菌种的鉴定。血清学技术提供了培养物菌种的鉴定。三、实验仪器和材料三、实验仪器和材料1 1冰箱:冰箱:0044。2 2恒温培养箱:恒温培养箱:363611,4242。3 3显微镜:显微镜:1010100100。4 4高压灭菌器。高压灭菌器。5 5 超净工作台。超净工作台。6 6 均质器或灭菌乳钵。均质器或灭菌乳钵。7 7
19、架盘药物天平:架盘药物天平:0g0g500g,500g,精确度精确度0.5g0.5g。8 8 灭菌广口瓶:灭菌广口瓶:500mL500mL。9 9 灭菌锥形瓶:灭菌锥形瓶:500mL500mL、250mL250mL。10 10 灭菌吸管:灭菌吸管:10mL10mL(具(具0.1 mL0.1 mL刻度)。刻度)。11 11 天菌培养皿:天菌培养皿:90mm90mm。12 12 灭菌小试管:内径灭菌小试管:内径3mm3mm50mm50mm。13 13 灭菌毛细管。灭菌毛细管。四、培养基和试剂四、培养基和试剂1 1缓冲蛋白胨水缓冲蛋白胨水(BP)(BP)2 2氯化镁孔雀绿氯化镁孔雀绿(MM)(MM)
20、增菌液增菌液3 3四硫酸钠煌绿四硫酸钠煌绿(TTB)(TTB)增菌液增菌液4 4亚硒酸盐胱氨酸亚硒酸盐胱氨酸(SC)(SC)增菌液增菌液5 5亚硫酸铋琼脂亚硫酸铋琼脂(BS)(BS)6 6DHLDHL琼脂琼脂7 7HEHE琼脂:按琼脂:按GB/T 4789.28GB/T 4789.2820032003中中4.214.21规定。规定。8 8TSITSI琼脂琼脂9 9蛋白胨水、靛基质试剂蛋白胨水、靛基质试剂10 10 尿素琼脂尿素琼脂(pH7.2)(pH7.2)11 11 氨基酸脱羧酶试验培养基氨基酸脱羧酶试验培养基12 12 沙门氏菌因子血清:按沙门氏菌因子血清:按2626种用于初步分型;种用于
21、初步分型;5757种用于进一步分型;种用于进一步分型;163163种用于详细分型。种用于详细分型。五、检验样品五、检验样品1 1 鲜猪肉、鲜牛肉;冻猪肉鲜猪肉、鲜牛肉;冻猪肉2 2 鲜牛奶、鲜鱼;冻鱼鲜牛奶、鲜鱼;冻鱼3 3 香肠、虾仁香肠、虾仁六、沙门氏菌检验流程六、沙门氏菌检验流程 检样检样 前增菌法前增菌法 直接增菌法直接增菌法 冻肉、蛋品、乳品及其它加工食品冻肉、蛋品、乳品及其它加工食品 鲜肉、鲜蛋、鲜乳及其它未经加工的食品鲜肉、鲜蛋、鲜乳及其它未经加工的食品 25g 25g BP 225mLBP 225mL 25g 25g 灭菌生理盐水灭菌生理盐水25mL 25mL 制成检样均质液制
22、成检样均质液 (36361 1)一般一般 4 h4 h,干蛋品,干蛋品 181824 h24 h10mL10mLMM(MM(或或TTB)100mLTTB)100mL 10mL10mLSC 100mLSC 100mL 检样均质液的半量检样均质液的半量MM(MM(或或TTB)100mLTTB)100mL 检样均质液的半量检样均质液的半量SC 100mL SC 100mL 42 18 42 1824 h 24 h (36361 1)181824 h 42 1824 h 42 1824 h 24 h (36361 1)181824 h24 h BS BS DHL(DHL(或或HEHE、WSWS、SS)
23、SS)(36361 1)404048 h 48 h (36361 1)181824 h 24 h 挑取可疑菌落挑取可疑菌落 TSITSI(斜面、底层、产气、(斜面、底层、产气、H H2 2S S)、蛋白胨水(靛基质)、尿素()、蛋白胨水(靛基质)、尿素(pH7.2pH7.2)、)、KCNKCN、赖氨酸、赖氨酸 H H2 2S S靛基质靛基质 H H2 2S S靛基质靛基质 H H2 2S S靛基质靛基质 非如左述的非如左述的 尿素尿素KCNKCN赖氨酸赖氨酸 尿素尿素KCNKCN赖氨酸赖氨酸 尿素尿素KCNKCN赖氨酸赖氨酸/各种反应结果各种反应结果 甘露醇、山梨醇甘露醇、山梨醇 ONPGON
24、PG 沙门氏菌血清学实验沙门氏菌血清学实验 沙门氏菌血清学实验沙门氏菌血清学实验 非沙门氏菌非沙门氏菌 非沙门氏菌非沙门氏菌 报告报告 七、操作步骤七、操作步骤 1 1、前增菌和增菌、前增菌和增菌 冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。以无菌操作取均应经过前增菌。以无菌操作取25g25g(mLmL),加在装有),加在装有225mL225mL缓冲蛋白胨水的缓冲蛋白胨水的500mL500mL广口瓶内。固体食品可先广口瓶内。固体食品可先应用均质器以应用均质器以80008000 10000r/min10000r/min打碎打碎1min1min,或用乳钵加灭菌砂磨碎
25、,粉状,或用乳钵加灭菌砂磨碎,粉状食品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化,于食品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化,于363611培养培养4h(4h(干蛋品培养干蛋品培养18h18h24h)24h),移取,移取10mL10mL,转种于,转种于100mL100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫酸钠煌绿增菌液氯化镁孔雀绿增菌液或四硫酸钠煌绿增菌液内,于内,于4242培养培养18h18h 24h24h。同时,另取。同时,另取10mL10mL,转种于,转种于100mL100mL亚硒酸盐胱氨亚硒酸盐胱氨酸增菌液内,于酸增菌液内,于363611培养培养18h18h24h24h。鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品鲜肉、鲜蛋、鲜乳或
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