DB41T2595-2024猪急性腹泻综合征诊断技术.pdf
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1、 ICS 65.020.30 CCS B 41 41 河南省地方标准 DB41/T 25952024 猪急性腹泻综合征诊断技术 2024-02-01 发布 2024-05-01 实施 河南省市场监督管理局 发 布 DB41/T 25952024 I 目次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 缩略语.1 5 临床诊断.1 6 样品采集及处理.2 7 病原分离与鉴定.3 8 RT-PCR 检测方法.3 9 荧光 PCR 检测方法.5 10 综合判定.7 附录 A(规范性)核酸提取及聚 PCR 反应溶液的配制.8 附录 B(资料性)SADS-CoV RT-PCR
2、 产物电泳图及荧光 PCR 扩增曲线图.10 DB41/T 25952024 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由河南省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位:河南省动物疫病预防控制中心、襄城县动物疫病预防控制中心、南阳市卧龙区动物疫病预防控制中心、修武县云台山镇综合行政执法大队。本文件主要起草人:班付国、闫若潜、王淑娟、赵雪丽、谢彩华、马震原、王东方、杨海波、王翠、郭育培、刘影、宋丹、刘礼杰、赵美雪、张利平、赵胜杰、冉晓龙、曹俊伟、张玲、杜燕玲。
3、DB41/T 25952024 1 猪急性腹泻综合征诊断技术 1 范围 本文件规定了猪急性腹泻综合征的临床诊断、样品采集及处理、病毒分离与鉴定、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和实时荧光 RT-PCR 的技术要求。本文件适用于猪急性腹泻综合征的临床诊断和检测。2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。SADS:猪急性腹泻综合征(Swine acute Diarrhoea Syndrome)SADS-CoV:猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute Diarrhoea Syndrome Coron
4、avirus)RT-PCR:反转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction)FQ-PCR:荧光-聚合酶链式反应(Fluorescence Quantitative-polymerase chain reaction)EDTA:乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid)PBS:磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline)DEPC:焦碳酸二乙酯(Diethypyrocarbonate)cDNA:互补脱氧核糖核酸(complementary DNA)vero:非洲绿猴
5、肾细胞(Verda Reno)5 临床诊断 5.1 流行病学 5.1.1 SADS 是由 SADS-CoV 引起的一种新型猪肠道冠状病毒病,该病毒可感染不同日龄的猪,仔猪最易感染,感染后 2 d6 d 发病,5 日龄以内的仔猪病死率最高可达 90以上,8 日龄以上的仔猪病死率相对较低;成年猪感染后多数只出现轻度腹泻,2 d3 d 后大部分猪可自行痊愈。5.1.2 发病猪及带毒猪为主要的传染源。主要通过直接接触传播,病猪可通过粪-口以及病毒污染的物品、饲料、垫料、设施设备及地面等传播。5.1.3 SADS 一年四季均可发生,冬春季多发。5.2 临床症状 发病仔猪出现急性腹泻、呕吐,脱水、体重迅速
6、下降或死亡;成年猪感染出现轻度腹泻。DB41/T 25952024 2 5.3 病理变化 小肠肠道变薄、变透明,肠内充满黄色水样物质,肠系膜充血;组织病理学检查,空肠和回肠内肠绒毛萎缩、脱落,肠绒毛上皮细胞变性、坏死。5.4 结果判定 易感动物符合5.1且出现5.2临床症状、5.3病理变化时,可判为疑似猪急性腹泻综合征。6 样品采集及处理 6.1 主要试剂 6.1.1 0.01 mol/L PBS(pH 7.4),按 A.1 和 A.2 配制。6.1.2 青霉素,浓度为 1000 IU/mL。6.1.3 链霉素,浓度为 500 IU/mL。6.2 用具 6.2.1 器械:解剖刀、剪刀、镊子、注
7、射器及针头、组织匀浆仪等。6.2.2 个人防护用具:防护服、防护镜、防护帽、防护靴、口罩、一次性手套等。6.2.3 采样记录用品:采样单、记号笔、防水标签等。6.2.4 其他:2 mL 离心管、0.22 m 微孔滤器、医用棉签、冰袋等。6.3 样品采集和运输 6.3.1 粪便及组织样品 无菌采集疑似 SADS-CoV 感染腹泻猪急性期的新鲜粪便(1.0 g2.0 g)或小肠中段(1.0 cm 2.0 cm),放入密封袋中,置于带有冰袋的保存箱中,送至实验室,附带的冰袋里的冰应未完全融化;如样品不能被及时送到实验室,应置于-20 冰箱中保存,保存期应不超过 1 个月。6.3.2 血清样品 采集疑
8、似 SADS-CoV 感染猪的血液样品,每只不少于 5 mL,室温放置 12 h24 h,分离血清,装入离心管中,密封后冷藏或冷冻保存。6.4 样品处理及保存 6.4.1 粪便样品 取 0.1 g0.2 g 新鲜粪便置于 2 mL 离心管中,加入 0.01 mol/L PBS(pH 7.4,含终浓度 1 000 IU/mL的青霉素、500 IU/mL 的链霉素)1.0 mL2.0 mL,摇匀,经 3 000 r/min 离心 10 min,取上清液,经0.22 m 微孔滤器过滤,分装,20 保存备用。如需长期保存,应置于-80 冰箱。6.4.2 组织样品 取 1.0 cm2.0 cm 小肠组织
9、,用剪刀剪碎后放入 2 mL 离心管中并加入 0.01 mol/L PBS(pH 7.4,含终浓度 1 000 IU/mL 的青霉素、500 IU/mL 的链霉素)2.0 mL,用组织匀浆仪研磨,20 反复冻融 3 次,摇匀,经 3 000 r/min 离心 10 min,取上清液,经 0.22 m 微孔滤器过滤,分装,20 保存备用。如需长期保存,应置于-80 冰箱。DB41/T 25952024 3 6.4.3 血清样品 置于2 8 冰箱中可保存一周,保存时间超过一周以上应置于-20 以下冷冻保存。7 病原分离与鉴定 7.1 试剂 7.1.1 D-Hanks 液。7.1.2 细胞培养液,按
10、 A.3 配制。7.1.3 细胞维持液,按 A.4 配制。7.1.4 0.25胰蛋白酶。7.1.5 胎牛血清。7.2 仪器设备 7.2.1 二级生物安全柜。7.2.2 倒置显微镜。7.2.3 二氧化碳培养箱。7.2.4 冷冻离心机。7.2.5 微量移液器(0.1 L0.25 L;0.5 L10 L;2 L20 L;20 L200 L;100 L1 000 L 等不同规格)。7.2.6 冰箱(2 8、20、80 等不同温度)。7.3 细胞 Vero细胞系。7.4 病毒的分离培养 7.4.1 单层细胞的制备:将 Vero 细胞分装在 25 cm2细胞培养瓶中,每瓶分装细胞悬液 7 mL,细胞浓度应
11、为 2105个/mL3105个/mL,37 5 CO2培养 24 h。7.4.2 细胞接种:将 6.4.1 或 6.4.2 中的过滤液(病毒培养液的 10)接种于经 D-Hanks 洗液冲洗过 2遍后的 Vero 单层细胞上,37 吸附 1.5 h,添加细胞维持液(含终浓度 10 g/mL 胰蛋白酶)至病毒培养总量,置 37 培养,连续观察 3 d4 d。盲传 3 代。7.5 病毒鉴定 对出现CPE(细胞面粗糙,颗粒增多,并可见空斑样小区,细胞逐渐脱落)的细胞培养液,选用第8章RT-PCR或第9章FQ-PCR进行核酸检测。7.6 结果判定 7.6.1 细胞盲传 3 代未见 CPE,且经 7.5
12、 方法检测阴性者,判为病毒分离阴性。7.6.2 对出现 CPE 的细胞培养液,经 7.5 方法检测阳性者,判为病毒分离阳性。8 RT-PCR 检测方法 8.1 试剂 DB41/T 25952024 4 8.1.1 核酸提取试剂盒。8.1.2 反转录及 PCR 试剂:M-MLV 5Reaction buffer(含 Mg2+)、2.5 mM dNTPs、M-MLV(200 U/L)、RNA 酶抑制剂(40 U/L)、10PCR 缓冲液(含 Mg2+)、Ex Taq DNA 聚合酶(5 U/L)。8.1.3 1TAE 缓冲液,按 A.5 配制。8.1.4 DEPC 处理水,按 A.6 配制。8.1
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