DB41T2595-2024猪急性腹泻综合征诊断技术.pdf

ICS 65.020.30 CCS B 41 41 河南省地方标准 DB41/T 25952024 猪急性腹泻综合征诊断技术 2024-02-01 发布 2024-05-01 实施 河南省市场监督管理局 发 布 DB41/T 25952024 I 目次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 缩略语.1 5 临床诊断.1 6 样品采集及处理.2 7 病原分离与鉴定.3 8 RT-PCR 检测方法.3 9 荧光 PCR 检测方法.5 10 综合判定.7 附录 A（规范性）核酸提取及聚 PCR 反应溶液的配制.8 附录 B（资料性）SADS-CoV RT-PCR 产物电泳图及荧光 PCR 扩增曲线图.10 DB41/T 25952024 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由河南省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：河南省动物疫病预防控制中心、襄城县动物疫病预防控制中心、南阳市卧龙区动物疫病预防控制中心、修武县云台山镇综合行政执法大队。本文件主要起草人：班付国、闫若潜、王淑娟、赵雪丽、谢彩华、马震原、王东方、杨海波、王翠、郭育培、刘影、宋丹、刘礼杰、赵美雪、张利平、赵胜杰、冉晓龙、曹俊伟、张玲、杜燕玲。DB41/T 25952024 1 猪急性腹泻综合征诊断技术 1 范围 本文件规定了猪急性腹泻综合征的临床诊断、样品采集及处理、病毒分离与鉴定、反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和实时荧光 RT-PCR 的技术要求。本文件适用于猪急性腹泻综合征的临床诊断和检测。2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。SADS：猪急性腹泻综合征（Swine acute Diarrhoea Syndrome）SADS-CoV：猪急性腹泻综合征冠状病毒（Swine acute Diarrhoea Syndrome Coronavirus）RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction）FQ-PCR：荧光-聚合酶链式反应（Fluorescence Quantitative-polymerase chain reaction）EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tetraacetic acid）PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline）DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethypyrocarbonate）cDNA：互补脱氧核糖核酸（complementary DNA）vero：非洲绿猴肾细胞（Verda Reno）5 临床诊断 5.1 流行病学 5.1.1 SADS 是由 SADS-CoV 引起的一种新型猪肠道冠状病毒病，该病毒可感染不同日龄的猪，仔猪最易感染，感染后 2 d6 d 发病，5 日龄以内的仔猪病死率最高可达 90以上，8 日龄以上的仔猪病死率相对较低；成年猪感染后多数只出现轻度腹泻，2 d3 d 后大部分猪可自行痊愈。5.1.2 发病猪及带毒猪为主要的传染源。主要通过直接接触传播，病猪可通过粪-口以及病毒污染的物品、饲料、垫料、设施设备及地面等传播。5.1.3 SADS 一年四季均可发生，冬春季多发。5.2 临床症状 发病仔猪出现急性腹泻、呕吐，脱水、体重迅速下降或死亡；成年猪感染出现轻度腹泻。DB41/T 25952024 2 5.3 病理变化 小肠肠道变薄、变透明，肠内充满黄色水样物质，肠系膜充血；组织病理学检查，空肠和回肠内肠绒毛萎缩、脱落，肠绒毛上皮细胞变性、坏死。5.4 结果判定 易感动物符合5.1且出现5.2临床症状、5.3病理变化时，可判为疑似猪急性腹泻综合征。6 样品采集及处理 6.1 主要试剂 6.1.1 0.01 mol/L PBS（pH 7.4），按 A.1 和 A.2 配制。6.1.2 青霉素，浓度为 1000 IU/mL。6.1.3 链霉素，浓度为 500 IU/mL。6.2 用具 6.2.1 器械：解剖刀、剪刀、镊子、注射器及针头、组织匀浆仪等。6.2.2 个人防护用具：防护服、防护镜、防护帽、防护靴、口罩、一次性手套等。6.2.3 采样记录用品：采样单、记号笔、防水标签等。6.2.4 其他：2 mL 离心管、0.22 m 微孔滤器、医用棉签、冰袋等。6.3 样品采集和运输 6.3.1 粪便及组织样品 无菌采集疑似 SADS-CoV 感染腹泻猪急性期的新鲜粪便（1.0 g2.0 g）或小肠中段（1.0 cm 2.0 cm），放入密封袋中，置于带有冰袋的保存箱中，送至实验室，附带的冰袋里的冰应未完全融化；如样品不能被及时送到实验室，应置于-20 冰箱中保存，保存期应不超过 1 个月。6.3.2 血清样品 采集疑似 SADS-CoV 感染猪的血液样品，每只不少于 5 mL，室温放置 12 h24 h，分离血清，装入离心管中，密封后冷藏或冷冻保存。6.4 样品处理及保存 6.4.1 粪便样品 取 0.1 g0.2 g 新鲜粪便置于 2 mL 离心管中，加入 0.01 mol/L PBS（pH 7.4，含终浓度 1 000 IU/mL的青霉素、500 IU/mL 的链霉素）1.0 mL2.0 mL，摇匀，经 3 000 r/min 离心 10 min，取上清液，经0.22 m 微孔滤器过滤，分装，20 保存备用。如需长期保存，应置于-80 冰箱。6.4.2 组织样品 取 1.0 cm2.0 cm 小肠组织，用剪刀剪碎后放入 2 mL 离心管中并加入 0.01 mol/L PBS（pH 7.4，含终浓度 1 000 IU/mL 的青霉素、500 IU/mL 的链霉素）2.0 mL，用组织匀浆仪研磨，20 反复冻融 3 次，摇匀，经 3 000 r/min 离心 10 min，取上清液，经 0.22 m 微孔滤器过滤，分装，20 保存备用。如需长期保存，应置于-80 冰箱。DB41/T 25952024 3 6.4.3 血清样品 置于2 8 冰箱中可保存一周，保存时间超过一周以上应置于-20 以下冷冻保存。7 病原分离与鉴定 7.1 试剂 7.1.1 D-Hanks 液。7.1.2 细胞培养液，按 A.3 配制。7.1.3 细胞维持液，按 A.4 配制。7.1.4 0.25胰蛋白酶。7.1.5 胎牛血清。7.2 仪器设备 7.2.1 二级生物安全柜。7.2.2 倒置显微镜。7.2.3 二氧化碳培养箱。7.2.4 冷冻离心机。7.2.5 微量移液器（0.1 L0.25 L；0.5 L10 L；2 L20 L；20 L200 L；100 L1 000 L 等不同规格）。7.2.6 冰箱（2 8、20、80 等不同温度）。7.3 细胞 Vero细胞系。7.4 病毒的分离培养 7.4.1 单层细胞的制备：将 Vero 细胞分装在 25 cm2细胞培养瓶中，每瓶分装细胞悬液 7 mL，细胞浓度应为 2105个/mL3105个/mL，37 5 CO2培养 24 h。7.4.2 细胞接种：将 6.4.1 或 6.4.2 中的过滤液(病毒培养液的 10)接种于经 D-Hanks 洗液冲洗过 2遍后的 Vero 单层细胞上，37 吸附 1.5 h，添加细胞维持液（含终浓度 10 g/mL 胰蛋白酶）至病毒培养总量，置 37 培养，连续观察 3 d4 d。盲传 3 代。7.5 病毒鉴定 对出现CPE（细胞面粗糙，颗粒增多，并可见空斑样小区，细胞逐渐脱落）的细胞培养液，选用第8章RT-PCR或第9章FQ-PCR进行核酸检测。7.6 结果判定 7.6.1 细胞盲传 3 代未见 CPE，且经 7.5 方法检测阴性者，判为病毒分离阴性。7.6.2 对出现 CPE 的细胞培养液，经 7.5 方法检测阳性者，判为病毒分离阳性。8 RT-PCR 检测方法 8.1 试剂 DB41/T 25952024 4 8.1.1 核酸提取试剂盒。8.1.2 反转录及 PCR 试剂：M-MLV 5Reaction buffer(含 Mg2+)、2.5 mM dNTPs、M-MLV（200 U/L）、RNA 酶抑制剂（40 U/L）、10PCR 缓冲液(含 Mg2+)、Ex Taq DNA 聚合酶(5 U/L)。8.1.3 1TAE 缓冲液，按 A.5 配制。8.1.4 DEPC 处理水，按 A.6 配制。8.1.5 1.5的琼脂糖凝胶，按 A.7 配制。8.1.6 DNA 分子量标准。8.2 仪器设备 8.2.1 PCR 扩增仪。8.2.2 核酸电泳仪和水平电泳槽。8.2.3 凝胶成像系统。8.2.4 二级生物安全柜。8.2.5 单道微量移液器（0.1 L0.25 L；0.5 L10 L；2 L20 L；20 L200 L；100 L1 000 L 等不同规格）。8.3 引物 上游引物SADS-P1：5-GCGGAATCTCGTGGTC-3；下游引物SADS-P2：5-ATGCCCAAGTCTGCCAAAGC-3。扩增产物大小为542 bp。8.4 检测程序 8.4.1 核酸提取 采用核酸提取试剂盒或全自动核酸提取仪提取各类样本中的病毒核酸。如在2 h内检测可将提取的核酸置于冰上保存，或置于20 冰箱保存。8.4.2 反转录（cDNA 的合成）8.4.2.1 反转录体系配制 反转录体系配制见表 1。体系配好后盖紧 PCR 反应管，并做好标记。表1 反转录体系配制表 单位为L 试剂成分 加入体积 M-MLV 5Reaction buffer(含Mg2+)4 2.5 mM dNTPs 4 M-MLV（200 U/L）0.5 RNA酶抑制剂（40 U/L）0.5 SADS-P2（20 M）1 总体积 10 8.4.2.2 RT-PCR 反应 DB41/T 25952024 5 按 8.4.2.1 的加样顺序全部加完后，充分混匀，瞬时离心，使液体都沉降到 PCR 反应管底。向每管中加入 8.4.1 中相应 RNA10 L，37 水浴 1 h 或置于 PCR 仪中 37 1 h，反应结束后于 70 反应15 min 灭活反转录酶，直接用于下面的 RT-PCR 扩增或实时荧光 RT-PCR 扩增。8.4.3 PCR 扩增 8.4.3.1 配制 PCR 反应体系 PCR 体系配制见表 2。体系配好后盖紧 PCR 反应管，并做好标记。表2 PCR 体系配制表 单位为L 试剂成分 加入体积 10PCR缓冲液(含Mg2+)2.5 2.5 mmol/L dNTPs 2 Ex Taq DNA聚合酶(5 U/L)0.25 SADS-P1（20 M）0.5 SADS-P2（20 M）0.5 DEPC处理水 16.25 总体积 22 8.4.3.2 PCR 反应 将 22 L PCR 反应混合液加入到每个 0.2 mL PCR 管；将 3 L cDNA 模板加入到 PCR 管。每次进行普通 PCR 扩增时均设阳性、阴性及空白对照。加入模板后，密封反应管，充分混匀，瞬时离心。将所有 PCR 管放在 PCR 仪中。按如下条件运行扩增程序：95 预变性 5 min 后，94 45 s，58 45 s，72 45 s 共 35 个循环，最后 72 延伸 10 min。反应结束后取出产物置于 4 待检。8.4.4 PCR 扩增产物的电泳检测 制备1.5的琼脂糖凝胶，在电泳槽中加入1TAE核酸电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取5 L10 L PCR 扩增产物和 1 L2 L 6电泳上样缓冲液混合后，分别加样到各凝胶孔中，取 5 L DNA分子量标准加到凝胶孔中。5 V/cm 恒压下电泳 30 min，将电泳好的凝胶置紫外投射仪或凝胶成像系统中观察结果，进行判定并做好试验记录。8.5 试验结果成立条件 SADS-CoV 阳性对照的 PCR 扩增产物电泳后在 542 bp 位置出现特异性条带，同时阴性对照的 PCR 扩增产物电泳后没有目的条带，则试验结果成立，见 B.1；否则结果不成立。8.6 结果判定 在试验结果成立的前提下，如果被检样品的PCR产物电泳后在542 bp位置上出现特异性扩增条带，判为 SADS-CoV 核酸阳性；被检样品无特异性扩增条带，判为 SADS-CoV 核酸阴性。9 荧光 PCR 检测方法 DB41/T 25952024 6 9.1 试剂 除不需要 TAE 核酸电泳缓冲液、电泳上样缓冲液、DNA 分子量标准外，其他试剂见 8.1。9.2 仪器设备 除不需要 PCR 扩增仪、核酸电泳仪、水平电泳槽和凝胶成像系统外，其他仪器设备见 8.2，并需要增加实时荧光 PCR 仪。9.3 引物和探针 上 游 引 物 SADS-P3：5 ACAGGTAAAGGCACTCCAGATCA-3；下 游 引 物 SADS-P4：5-GCATTCGCCAGCGTTTTT-3；TaqMan探针SADS-Probe：FAM-CAGATTGGTTATTGGGTTGAA-BHQ1。9.4 检测程序 9.4.1 核酸提取 按8.4.1规定。9.4.2 反转录（cDNA 的合成）按8.4.2规定。9.4.3 荧光 PCR 扩增 9.4.3.1 配制荧光 PCR 反应体系配制 PCR 体系配制见表 3。体系配好后盖紧 PCR 反应管，并做好标记。表3 实时荧光 RT-PCR 体系配制表 单位为L 试剂成分 加入体积 10PCR缓冲液(含Mg2+)2.5 2.5 mmol/L dNTPs 2 Ex Taq DNA聚合酶(5 U/L)0.25 SADS-P3（20 M）0.5 SADS-P4（20 M）0.5 SADS-Probe 1.0 DEPC处理水 15.25 总体积 22 9.4.3.2 荧光 PCR 反应 将 22 L PCR 反应混合液加入到每个 0.2 mL PCR 管；将 3 L cDNA 模板加入到 PCR 管。每次进行PCR 扩增时均设阳性、阴性及空白对照。加入模板后，密封反应管，瞬时离心。将所有 PCR 管放在荧光PCR 仪中。95 预变性 2 min，95 变性 15 s，60 退火 40 s，共 40 个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号收集，荧光模式设为 FAM/NONE 标记模式。9.5 试验结果成立条件 DB41/T 25952024 7 SADS-CoV 阳性对照的 Ct 值应30 且出现特异性扩增曲线，阴性对照应无 Ct 值或 Ct 值40 且无特异性扩增曲线，试验结果有效，见 B.2；否则应重新进行试验。9.6 结果判定 9.6.1 在试验结果成立的前提下，被检样品 Ct 值35 且出现特异性扩增曲线，判为 SADS-CoV 核酸阳性。9.6.2 当无 Ct 值或 Ct 值38 且无特异性扩增曲线，判为 SADS-CoV 核酸阴性。9.6.3 当 35Ct 值38 且出现特异性扩增曲线，判为疑似。对疑似样品，模板量加倍（6 l）进行复检 1 次，若 Ct 值38 且出现特异性扩增曲线即判为 SADS-CoV 核酸阳性，否则判为 SADS-CoV 核酸阴性。10 综合判定 10.1 疑似 符合5.4，可判为疑似猪急性腹泻综合征。10.2 确诊 符合10.1，且经病原分离与鉴定（第7章）、RT-PCR检测方法（第8章）、FQ-PCR检测方法（第9章）任一项判为核酸阳性的，可判定为猪急性腹泻综合征确诊病例。DB41/T 25952024 8 A A 附录A （规范性）核酸提取及聚 PCR 反应溶液的配制 A.1 0.1 mol/L 的磷酸盐缓冲液（PBS,pH 7.4）氯化钠（NaCl）85.00 g 磷酸氢二钠（Na2HPO4）15.49 g 磷酸二氢钠（NaH2PO4）2.03 g 加去离子水至 1000 mL 或者 氯化钠（NaCl）80.0 g 氯化钾(KCl)2.0 g 磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）30.0 g 磷酸二氢钾（KH2PO4）2.0 g 加去离子水至 1000 mL A.2 0.01 mol/L PBS（pH 7.4）0.1 mol/L PBS 100 mL 去离子水 900 mL 103 kPa 高压蒸汽灭菌 30 min，室温或 4 冰箱保存。A.3 细胞培养液 DMEM培养液 500 mL 胎牛血清 50 mL 100倍双抗 5.5 mL 充分混合均匀后4 冰箱保存。A.4 细胞维持液 DMEM培养液 500 mL 胎牛血清 10 mL 100倍双抗 5.1 mL 充分混合均匀后4 冰箱保存。A.5 1 TAE核酸电泳缓冲液 Tris碱，24.2 g；冰乙酸，5.71 mL；0.5 mol/L EDTA(pH8.0)，10 mL；加蒸馏水至 100 mL，使用时用蒸馏水作 50 倍稀释，即为 1TAE核酸电泳缓冲液。A.6 DEPC 处理水 DB41/T 25952024 9 DEPC 1 mL 去离子水 1000 mL 充分混匀，将瓶盖拧松后置于37 放置过夜，高压灭菌。A.7 1.5的琼脂糖凝胶 琼脂糖 0.75 g 1TAE 缓冲液 50 mL 溴化乙锭溶液（10 mg/mL）2.5 L 称取 0.75 g琼脂糖，置于 200 mL锥形瓶中，加入 50 mL 1TAE缓冲液，加热溶解，冷却至 50 60 时加入 2.5 L溴化乙锭溶液，倒入胶槽内自然凝固。A.8 阳性对照 经 Vero 细胞培养纯化、灭活的 SADS 细胞毒。A.9 阴性对照 Vero细胞培养物。DB41/T 25952024 10 B B 附录B （资料性）SADS-CoV RT-PCR 产物电泳图及荧光 PCR 扩增曲线图 B.1 SADS-CoV 荧光PCR产物电泳图见图B.1。注：m：2000 bp DNA Ladder；1：SADS-CoV阳性对照；2：阴性对照 图 B.1 SADS-CoV RT-PCR 扩增图 B.2 SADS-CoV实时荧光PCR扩增曲线图见图B.2。图 B.2 SADS CoV 实时荧光 PCR 扩增曲线图