RNA-seq技术原理及应用.ppt
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1、RNA-seq技术原理及应用主要内容1、RNA-seq技术简介技术简介2、RNA-seq技术原理技术原理3、RNA-seq结果分析结果分析4、RNA-seq技术应用技术应用一、RNA-seq技术简介1.诞生于诞生于 20 世纪世纪 70 年代的年代的 Sanger 法是最早被法是最早被广泛应用的广泛应用的 DNA 测序技术,也是完成人类基因组测序技术,也是完成人类基因组计划的基础。计划的基础。2.2005 年以来,以年以来,以 Roche 公司的公司的 454 技术、技术、Illumina 公司的公司的 Solexa 技术和技术和 ABI 公司公司的的 SOLiD 技术为标志的新一代测序技术相
2、继诞生技术为标志的新一代测序技术相继诞生,又称作,又称作深度测序技术。深度测序技术。3.把高通量测序技术应用到由把高通量测序技术应用到由 RNA 逆转录生成逆转录生成的的 cDNA 上,从而获得来自不同基因的上,从而获得来自不同基因的RNA 片段片段在特定样本中的含量,这就是在特定样本中的含量,这就是 RNA测序或测序或 RNA-seq。二、RNA-seq技术原理Illumina/Solexa 测序技术的基本原理是边合成测序技术的基本原理是边合成边测序,即测序过程是以边测序,即测序过程是以 DNA 单链为模板,在生单链为模板,在生成互补链时,利用带荧光标记的成互补链时,利用带荧光标记的 dNT
3、P 发出不同发出不同颜色的荧光来确定不同的碱基。颜色的荧光来确定不同的碱基。新加入新加入 dNTP 的末端被可逆的保护基团封闭,的末端被可逆的保护基团封闭,既保证单次反应只能加入一个碱基,又能在该碱既保证单次反应只能加入一个碱基,又能在该碱基读取完毕后,将保护基团除去,使得下一个反基读取完毕后,将保护基团除去,使得下一个反应可继续进行。为了增加荧光强度,使之更易被应可继续进行。为了增加荧光强度,使之更易被成像系统所采集,该技术在测序之前还需要对待成像系统所采集,该技术在测序之前还需要对待测片段做桥式扩增。测片段做桥式扩增。Shot Gun文库构建DNA片段固定簇序列读取反应图像获得和处理序列组
4、装和比较单条模板扩增1234T T T T T G C T 二、RNA-seq技术原理二、RNA-seq技术原理RNA-seq实验流程图为了便于测序数据的发布和共享,高通量为了便于测序数据的发布和共享,高通量测序数据以测序数据以 FASTQ 格式来记录所测的碱基读格式来记录所测的碱基读段和质量分数。段和质量分数。NCBI、EBI、DDBJ 等数据等数据中心建立了大容量的数据库中心建立了大容量的数据库 SRA来存放共享来存放共享的测序数据。的测序数据。三、RNA-seq结果分析三、RNA-seq结果分析RNA-seq 数据的数据的基本处理基本处理1.序列定位算法序列定位算法(1)空位种子索引法:
5、首先将读段切分,)空位种子索引法:首先将读段切分,并选取其中一段或几段作为种子建立搜索索并选取其中一段或几段作为种子建立搜索索引,再通过查找索引、延展匹配来实现读段引,再通过查找索引、延展匹配来实现读段定位定位,通过轮换种子考虑允许出现错配的各,通过轮换种子考虑允许出现错配的各种可能的位置组合(种可能的位置组合(Maq)。(2)Burrows-Wheeler 转换技术:通过转换技术:通过B-W 转换将基因组序列按一定规则压缩并建立转换将基因组序列按一定规则压缩并建立索引,再通过查找和回溯来定位读段,在查索引,再通过查找和回溯来定位读段,在查找时可通过碱基替代来实现允许的错配找时可通过碱基替代来
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