分子生物学常用技术专题培训课件.ppt
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1、分子生物学常用技分子生物学常用技术术分子生物学常用技术分子生物学常用技术 凝胶电泳凝胶电泳 分子杂交分子杂交 聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR)技术技术 DNA的物理图谱的物理图谱 DNA序列测定序列测定 基因芯片基因芯片第一节第一节 凝胶电泳凝胶电泳(gel electrophoresis)电泳概念电泳概念基本原理基本原理 Q 6r:迁移率迁移率 Q:电荷量电荷量 r:粒子半径(分子量)粒子半径(分子量):介质粘度介质粘度 电泳的用途电泳的用途分离分离鉴定纯度鉴定纯度测定分子量测定分子量凝胶电泳的种类凝胶电泳的种类琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、琼脂糖
2、凝胶电泳一、琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis)分离核酸原理分离核酸原理 操作要点操作要点 应用范围应用范围(一)(一)分离核酸原理分离核酸原理 电荷效应电荷效应 分子筛效应分子筛效应 分子构象分子构象1.电荷效应电荷效应 核酸是核酸是两性电解质两性电解质 pH=3.5,正电荷正电荷 pH=8.08.3,负电荷,正极负电荷,正极2.分子筛效应分子筛效应 小分子小分子移动快移动快,大分子移动慢,大分子移动慢3.分子构象分子构象闭环超螺旋闭环超螺旋线状线状DNA开环开环DNA+-(二)操作要点(二)操作要点支持物支持物 凝胶浓度的选择凝胶浓度的选择 DNA分子量
3、标准分子量标准 电泳缓冲液电泳缓冲液 样品制备样品制备 电泳条件电泳条件 DNA电泳染色电泳染色 DNA片段的回收片段的回收 1.支持物支持物商品化的琼脂糖商品化的琼脂糖琼脂糖种类琼脂糖种类普通普通低熔点低熔点高纯高纯高筛分高筛分熔点熔点8090几十几十V/cm温度:温度:1525 潜水电泳潜水电泳7.电泳染色电泳染色 溴乙锭溴乙锭(ethidium bromide,EB)结构及染色原理结构及染色原理 染色方法染色方法加入凝胶液中加入凝胶液中 电泳结束后电泳结束后染色染色 EB染色原理染色原理紫外灯下显色紫外灯下显色8.DNA片段的回收片段的回收低熔点琼脂糖法低熔点琼脂糖法 透析袋电洗脱法透析
4、袋电洗脱法(5kb)DEAE-纤维素膜法纤维素膜法(0.55kb)(三)应用范围(三)应用范围 DNA的分离、纯化和鉴定的分离、纯化和鉴定 限制性酶切图谱分析限制性酶切图谱分析 重组体的分离、鉴定重组体的分离、鉴定 杂交分析杂交分析 PCR产物的分离鉴定产物的分离鉴定 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)分离原理分离原理 操作要点操作要点 优点优点 应用范围应用范围(一)分离原理(一)分离原理 电荷效应电荷效应 分子筛效应分子筛效应PAGE支持物支持物单体丙烯酰胺单体丙烯酰胺(
5、Acr)交联剂甲叉双丙烯酰胺交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)催化剂过硫酸胺催化剂过硫酸胺(AP)加加速速剂剂N,N,N,N-四四甲甲基基乙乙二二胺胺(TEMED)聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶(二)操作要点(二)操作要点凝胶的分类凝胶的分类 凝胶浓度的选择凝胶浓度的选择 凝胶液的配制凝胶液的配制 凝胶中凝胶中DNA的检测的检测DNA片段的回收片段的回收 1.凝胶的分类凝胶的分类非变性非变性凝胶:凝胶:dsDNA变性凝胶变性凝胶:ssDNA尿素尿素甲酰胺甲酰胺SDS2.凝胶浓度的选择凝胶浓度的选择3.凝胶液的配制凝胶液的配制 试剂(ml)制备浓度(%)3.5 5.08.0122030%Acr11.6
6、 16.6 26.640.066.6ddH2O67.7 62.7 52.739.312.75XTBE20.0 20.0 20.020.020.010%AP0.70.70.70.70.7TEMED35ul/100mlPAGE装置装置电电 泳泳4.凝胶中凝胶中DNA的检测的检测溴乙锭染色法溴乙锭染色法 银盐染色法银盐染色法 甲醛甲醛 还原还原放射自显影法放射自显影法 Ag+DNA Ag(黑褐色)黑褐色)5.DNA片段的回收片段的回收压碎浸泡法压碎浸泡法 1kb 纯度高,回收率低纯度高,回收率低(三)(三)PAGE优点优点机械强度好、化学稳定性高机械强度好、化学稳定性高分辨率高分辨率高 载样量大载样
7、量大 回收的回收的DNA纯度高纯度高 (四)(四)PAGE应用范围应用范围分离、纯化和鉴定分离、纯化和鉴定RNA和小分子和小分子DNA DNA序列分析序列分析 PCR产物鉴定产物鉴定 蛋白质的检测和分析蛋白质的检测和分析 第二节第二节 分子杂交分子杂交分子杂交的基本原理分子杂交的基本原理固相支持物固相支持物探针探针几种常用杂交技术几种常用杂交技术一、分子杂交的基本原理一、分子杂交的基本原理 核酸的变性和复性核酸的变性和复性分分子子杂杂交交DNA-DNADNA-RNA杂交条件杂交条件 靶分子靶分子 探针探针 杂交袋杂交袋 杂交炉杂交炉杂交种类杂交种类被检核酸种类和方法被检核酸种类和方法 原位杂交
8、原位杂交斑点杂交斑点杂交Southern杂交杂交Northern杂交杂交Western杂交杂交 反应介质反应介质 液相杂交液相杂交 固相杂交固相杂交()二、固相支持物二、固相支持物 固相支持物的特性固相支持物的特性结合能力强结合能力强不影响杂交反应不影响杂交反应结合牢固结合牢固 非特异性吸附少非特异性吸附少 机械性能良好机械性能良好 固相支持物的种类固相支持物的种类 硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜 (nitrocellulose filter membrane)尼龙膜尼龙膜(nylon membrane)1.硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜 特点特点吸附吸附ssDNA和和RNA 杂交信号本底低杂交信
9、号本底低 不足不足不适于重复杂交不适于重复杂交滤膜较脆滤膜较脆 不适于电转移印迹法不适于电转移印迹法 对对DNA小片段小片段(缺口翻译缺口翻译 操作简便操作简便 DNA/cDNA 探针探针 DNA的的5末端标记末端标记(5end labeling)碱性磷酸酶碱性磷酸酶T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶 标记原理标记原理 制备寡核苷酸探针制备寡核苷酸探针 制备短的制备短的DNA/RNA探针探针 DNA的的5末端标记末端标记四、四、Southern 杂交杂交Southern blotting/DNA blotting1975年,年,Edwen Southern等等印迹印迹(blotting):转移转移
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