DB2308∕T 182-2023 稻瘟病菌无毒基因检测PCR法技术规范(佳木斯市).pdf
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1、ICS 65.020.20B 05黑 龙 江 省 佳 木 斯 市 地 方 标 准DB23DB2308/T 1822023稻瘟病菌无毒基因检测 PCR 法技术规范2023-12-11 发布2024-01-11 实施佳木斯市市场监督管理局发布DB2308/T 1822023I前言本文件按照 GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第 1 部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件某些内容可能涉及专利,本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由黑龙江省佳木斯市农业农村局提出并归口。本文件由黑龙江省佳木斯市市场监督管理局批准发布。本文件起草单位:黑龙江省农业科学院水稻研究所。本文件
2、主要起草人:陆文静、周通、王桂玲、周雪松、韩笑。本文件 2023 年首次发布。DB2308/T 18220231稻瘟病菌无毒基因检测 PCR 法技术规范1范围本文件规定了稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)无毒基因检测 PCR 法技术规范。包括分子检测原理、仪器设备、试剂及样品、防污染措施、实验步骤及结果分析。本文件适用于黑龙江省佳木斯地区水稻稻瘟病菌无毒基因 AVR-Pii、AVR-Pik、AVR-Pita、AVR-Piz-t、AVR-Pia、AVR-Co39 的 PCR 检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的,凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件
3、。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 19495.2转基因产品检测 实验室技术要求3术语和缩略语下列术语和缩略语适用于本标准。3.1正向引物:处于 DNA 双链上游的引物,简称 F 引物。3.2反向引物:处于 DNA 双链下游的引物,简称 R 引物。3.3DNA:Deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸。3.4PCR:Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应DB2308/T 182202323.5Goldenview:核酸染料,替代溴化乙锭。3.6DNA Marke
4、r:标准分子量的核酸标记。4原理提取稻瘟病菌菌丝 DNA,根据无毒基因保守区域序列设计特异性引物,对样品进行 PCR 扩增,根据序列比对结果,依据是否扩增得到预期的 DNA 片段大小的序列来判断样品是否携带该无毒基因。5仪器设备电子天平、瓷质研钵、研杵、移液枪、水浴锅、高速离心机、核酸浓度测定仪(NanoDrop 2000)、基因扩增仪、琼脂糖电泳槽及电泳仪、凝胶成像系统,其它相关仪器设备。6试剂及样品干燥的稻瘟病菌丝 0.05 g0.1 g、10%CTAB、5 M NaCl、0.5 M EDTA(pH 8.0)、1 M Tris(pH8.0)、1TE 缓冲液、氯仿:异戊醇(24:1)、75%
5、乙醇、Goldenview 等。除非另有说明,仅使用分析纯试剂和 dd H2O 或符合 GB/T 6682 规定的一级水。7实验过程防污染措施检测过程中防止污染的措施按照 GB/T 19495.2 中的规定执行。8实验步骤8.1稻瘟病菌菌丝 DNA 提取取单孢培养后烘干的菌丝 0.1 g 于研钵中加入液氮用研杵研磨,菌粉转入 2 mL 灭菌离心管,并加入 65 预热的 DNA 提取缓冲液 700 L,盖盖混匀,置于水浴锅内 65 温浴 1 h(期间间隔 15 min摇动混匀,使 DNA 提取缓冲液与菌丝充分混合,保证菌丝 DNA 的提取效率)。12000 r/min 离心 10min,取上清液
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