基于甲基化芯片及测序技术筛选缺血性脑卒中的DNA甲基化分子标志物.pdf
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1、学校代码 10459学号或申请号学1512263044密 级_却刷上多硕士学位论文国家自然科学基金资助项目基于甲基化芯片及测序技术筛选 缺血性脑卒中的DNA甲基化分子标志物学科门类:理学专业名称:遗传学培养院系:基础医学院 学位论文原创性声明本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研 究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体,均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者:日期:年 月 日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品,
2、知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留或向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅;本人授权郑州 大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学 位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时,第一署名单位仍然为郑 州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者:日期:年 月 日本论文获得国家自然科学基金面上项目资助项目名称:力0X54。基因启动子区CpG-SNPs与DNA甲基化互作 对缺血性脑卒中易感性的影响项目编号:81571154
3、基于甲基化芯片及测序技术筛选缺血性脑卒中的DNA甲基化分子标志物研究生:张旭冉导师:郑红教授郑州大学基础医学院医学遗传与细胞生物学系 河南郑州450001摘要研究背景和目的:脑卒中(Stroke)是一种急性的脑血管疾病,是由于局部血液循环障碍所导 致的神经功能缺损综合症,具有死亡率高、发病率高、致残率高的特点,是全 世界第二大死亡原因,也是成年人致残的主要原因。脑卒中按照病因可分为缺血性脑卒中(Ischemic Stroke,IS)和出血性脑卒 中(Hemorrhagic Stroke,HS),IS约占脑卒中总数的87%。在我国,脑血管疾 病的死亡率和发病率显著高于心血管疾病,因此,脑卒中患者
4、需要大量的社会 关注和医疗资源投入,寻找防治缺血性脑卒中的生物标志物尤为迫切。Ana M.Gomez-Uriz的研究小组发现,在肥胖的缺血性脑卒中患者中,KCNQ1启动子区甲基化水平可作为诊断IS的生物标志物。周淑宇等人的研究发 现,在缺血性卒中患者中CDKN2B甲基化水平能够影响主动脉弓的钙化程度。已有大量研究表明,许多疾病以及重要的生物过程受到表观遗传的调控。因此,从DNA甲基化的角度研究其对缺血性脑卒中的影响为我们提供了新的思路。DNA特定位点的甲基化修饰广泛存在于原核生物和真核生物中,能引起染色质 T的结构、DNA构象、DNA的稳定性及DNA与蛋白质的相互作用方式的改变,从而调控基因的
5、表达,参与代谢途径调节。DNA的甲基化主要发生在基因启动 子区CpG岛,其甲基化状态的确定可以通过DNA甲基化测序的方法来实现。目前,从全基因组水平对IS的DNA甲基化水平进行研究未见有报道。因 此,本课题应用 Illumina Infinium Methylation EPIC BeadChip(850K 芯片)及 MethylTarget(目的区域甲基化水平测序),对IS患者与正常人外周血全基因组 甲基化的差异水平进行分析,筛选IS患者DNA甲基化水平显著变化的基因,最终,利用生物信息学的方法进行数据分析和挖掘,以期寻找与IS发生、发展 相关基因的DNA甲基化分子标志物。IS甲基化分子标志
6、物的发现不仅有助于全 面揭示IS发生的表观遗传分子机制,更重要的是可为IS的预防、诊断、个体化 治疗及预后提供非常有价值的线索及可靠的科学依据。材料与方法:1.1缺血性脑卒中患者的筛选根据WHO发布的缺血性脑卒中的诊断标准,并排除其它疾病,自2017 年3月至2017年10月,在河南中医药大学第一附属医院住院的缺血性脑卒中 患者中,按照严格的纳入标准进行选取,其中:第一步初筛人群包括:3例IS患者,分别是2例男性和1例女性,平均年 龄为57岁。第二步验证人群包括:60例IS患者,分别是36例男性和24例女性,平 均年龄为55岁。1.2健康对照组的选取随机收录与IS组同一时间段体检的受试者,其中
7、:第一步初筛人群包括:对照组为3例,分别是2例男性和1例女性,平均 年龄53岁。第二步验证人群包括:对照组为60例,分别是31例男性和29例女性,平均年龄58岁。1.3实验方法1.3.1利用Illumina 850K DNA甲基化芯片对初筛的3例缺血性脑卒中患者和3 例健康对照者的外周血液样本进行全基因组DNA甲基化位点检测。对比两组具 II有显著差异(p GO 分析(Gene Ontology Analysis,GO)进行生物信息学分析,选择与IS相关并有DNA甲基化 表达差异的基因。1.3.2扩大样本量至60例IS样本与60例健康对照,进行MethylTarget(目的区 域甲基化水平测序
8、)以验证。结果:1.850K DNA甲基化芯片检测得到:622个有统计学意义的甲基化差异CpG 位点,共涉及278个基因(Diffscore值小于-13或大于13;且Delta_ Beta 大于0.1 7或小于-0.1 7,即为差异甲基化基因)。2.DNA目的片段甲基化测序对19个候选基因ERCC5,TGFBI,ABCG1,ATP10A,CYP2E1,HOXA4,PCDHB7,ARL4C,KLF1L SULF2,AD ARB 2,GDF15,CDH15,CAMTAI,SMG6,RNF144b)验证后得至IJZBCZ/,ADARB2,ATP10A,CAMTAI,CDH15,COL9A2,TGFB
9、1共计7个基因,在病例和对照组之间的甲基化水平差异具有统计学 意义。(P-value0.05(Ttest)&P-value0.05(Utest)&P-value0.05(Logistic)3.目的片段甲基化测序结果显示:在IS患者组较健康对照组甲基化 程度升高,ffi ABCAh AD ARB 2,ATP10A,CDH15,COL9A2,TGFB1 在 IS患者组较健康对照组甲基化程度降低。结论:1.本课题应用全基因组甲基化芯片及目的区域甲基化水平测序,对IS患者与正 常人外周血全基因组甲基化的差异水平进行分析,筛选出ABCALADARB2,ATP10A,CDH15,COL9A2,TGFBL
10、共 7 个基因启动子区的 CpG岛甲基化水平可能成为缺血性脑卒中的DNA甲基化分子标志物。2.通过生物信息学分析,ADARB2,ABCA1,Z7P/0Z和TGF5/可能分别通过 介导胆固醇转运、磷脂转运以及调节基因表达等功能成为缺血性脑卒中的保 护因素。CDH15,COL9A2,可能通过介导细胞间粘附作用、参与胶原蛋白的合成与分解等功能而成为缺血性脑卒中的危险因素。III关键词:缺血性脑卒中 850KDNA甲基化芯片分子标志物IVDNA Methylation Molecular Markers ScreeningFor Ischemic StrokeBy Beadchip and Seque
11、ncing TechnologyPostgraduate:Xuran Zhang Supervisor:Prof.Hong Zheng Department of Medical Genetics and Cell Biology School of Basic Medical Sciences,Zhengzhou University Zhengzhou,450001AbstractBackground and Purpose:Stroke is an acute cerebrovascular disease,it is a neurological deficit syndrome ca
12、used by local blood circulation disorders.It has the characteristics of high mortality,high morbidity and high disability rate.It is the second leading cause of death in the world.It is also the main cause of adult lead to be disability.Stroke generally can bedivided into Ischemic Stroke(IS)and Hemo
13、rrhagic Stroke(HS),while IS takes part in 87%of the total.In China,the mortality and morbidity of cerebrovascular disease is significantly higher than that of cardiovascular disease.Therefore,stroke patients need a lot of social attention and medical resources to find biomarkers to prevent and treat
14、 ischemic stroke.The Ana M.G 6 mez-rizs team found that methylation levels in the KCNQ1 promoter region could be used as biomarkers in the diagnosis of IS in obese ischemic stroke patients.Zhou Shuyu and his team found that CDKN2B methylation levels in ischemic stroke patients can affect calcificati
15、on of the aortic arch.Many studies have shown that many diseases and important biological processes are regulated by epigenetics.Therefore,the study of the effect of DNA methylation on disease provides us with a new idea.Methylation modification at specific sites of DNA exists widely in prokaryotes
16、and eukaryotes,which can induce the stability of chromatin conformation and the change of interaction between DNA and protein,thus regulating gene expression,participate in the regulation of metabolic pathway.The methylation of DNA occurs mainly in the CpG island of gene promoter region,and its meth
17、ylation status can be determined by the method of DNA methylation sequencing.Therefore,our study apply technique of Illumina Infinium Methylation EPIC BeadChip(850K Chip)and MethyTarget(regional methylation sequencing)for differential DNA methylation analysis of IS patients and normal controls.The a
18、im is to select genes that significantly methylated altered in DNA methylation,and followed by gene functional analysis as to search for molecular markers of DNA methylation related to the occurrence and development of IS genes.Research object:1.1 Selection of IS patientsAccording to the diagnostic
19、criteria of WHO ischemic stroke and excluding other diseases,strict selection was made among the IS patients hospitalized in The First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine from March 201 7 to October 201 7.Step l.The primary screening crowd included 2 cases were ma
20、le(66.7%),1 case was female,the average age was 57 years old.Step 2.A total of 60 people were examined,including 36 males and 24 females,with an average age of 55 years.1.2 Selection of control groupSubjects who were randomly selected for physical examination in the same time period as the IS group:
21、VIStep l.The primary screening crowd included 3 cases in the control group,including 2 males(66.7%)and 1 female(mean age 53 years).Step 2.The examined people included 60 cases in the control group,of which 31 cases were males,29 cases were females with an average age of 58 years.1.3 Methods1.3.1 Ill
22、umina 850K DNA methylation microarray was used to detect the genomic DNA methylation sites in peripheral blood samples from 3 patients with ischemic stroke and 3 healthy controls.The methylation sites of the two groups were significantly different(P ATP10A.CYP2E1 HOX4A、PCDHB7.ARL4C、KLF11.SULF2、AD AR
23、B 2、GDF15、CDH15、CAMTAI、SMG6.RNF144b were selected,a total of 7 genes were obtained from ABC Al ADARB2、ATP10A CAMTAI CDH15、COL9A2、TGFBI.The difference of DNA methylation level between cases and controls was statistically significant(P value 0.05 Ttest&P-value 0.05 U test&P-value VIIATP10A、CDHI5、COL9A
24、2、TGFBI in IS group was lower than that in the healthy control group.Conclusion:1.There are seven genes have different levels of DNA methylation in peripheral blood of ischemic stroke patients and healthy people,they are ABC Al,ADARB2,ATP10A,CAMT AL CDH15,COL9A2,TGFBI.The methylation level ofCpG isl
25、and in the promoter region of these genes may be used as molecular markers of DNA methylation for the prevention and treatment of ischemic stroke.2.The genes(ADARB2,ABCA1,ATP10A,TGFB 1)were able to inhibit ischemic stroke by mediating cholesterol transport,phospholipid transport,and regulating gene
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