DB32∕T 4565-2023 埃及血吸虫核酸检测 重组酶介导等温扩增法(江苏省).pdf
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1、!7,发布出版埃及血吸虫核酸检测重组酶介导等温扩增法Detection of nucleic acid of Schistosoma haematobiumRecombinaseaided amplification assay2023-09-22 发布2023-10-22 实施CCS C 62DB32/T 45652023ICS 11.020中 国 标 准.江苏省市场监督管理局DB32/T 45652023前言本文件按照 GB/T 1.12020 标准化工作导则第 1 部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文
2、件由江苏省卫生标准化技术委员会提出并归口。本文件起草单位:江苏省血吸虫病防治研究所、首都医科大学附属北京友谊医院、江苏省血液中心、江苏省国际旅行卫生保健中心(南京海关口岸门诊部)。本文件主要起草人:杨坤、赵松、李伟、张键锋、邹洋、林红、孙立新、张乔乔、黄玉政、施亮、王鑫瑶、何健。DB32/T 45652023埃及血吸虫核酸检测重组酶介导等温扩增法1 范围本文件描述了检测人体尿液中埃及血吸虫核酸的重组酶介导核酸等温扩增法。本文件适用于各级疾病预防控制机构和医疗机构对埃及血吸虫核酸的检测。注:埃及血吸虫的基本信息、流行病学及临床表现见附录 A。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用
3、而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法。3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 重组酶介导核酸等温扩增技术 recombinase-aided amplification;RAA一种利用重组酶、单链结合蛋白和 DNA 聚合酶在等温条件下(一般为 39)进行核酸扩增的技术。注:其原理为重组酶与引物紧密结合扫描双链 DNA,当搜索到与引物同源的序列时,使双链 DNA 解旋,单链结合蛋白防止单链 DNA 复性,引物在 DNA 聚合酶作用
4、下沿模板链延伸,合成新的 DNA 互补链,5 min15 min 就可实现用仪器检测目的靶标的扩增。4 仪器与设备4.1 RAA恒温核酸扩增检测仪带有恒温(39 1)扩增功能的荧光检测仪。荧光检测激发波长 480 nm,发射波长 520 nm。4.2 恒温振荡混匀仪带有恒温功能(39 1),且能把固体、液体物质充分混匀。4.3 离心机相对离心力1 500 g。4.4 微量可调移液器量程为 100 L1 000 L、20 L200 L、2 L20 L 及 0.5 L10 L。1DB32/T 456520235 试剂与材料5.1 试剂体液核酸提取试剂盒、RAA 扩增反应体系及缓冲液(也可采用等效的
5、商品试剂盒)、无水乙醇和水(符合 GB/T 6682 的要求)。5.2 材料离心管(50 mL、1.5 mL)及离心管架、PCR 管(0.2 mL)及管架、微量可调移液器配套吸头、一次性使用敷料镊、一次性医用手套和一次性医用口罩。5.3 引物与探针扩增埃及血吸虫细胞色素 C 氧化酶相关基因(COX1)基因的特异性引物及探针,如表 1 所示。表 1埃及血吸虫 COX1 基因引物与探针引物/探针正向引物反向引物探针aa 探针序列的第 31位碱基修饰荧光报告基团羧基荧光素(FAM)、第 35位碱基修饰淬灭基团以及第 33位碱基修饰四氢呋喃残基。序列(53)CTTGATTATATATGCTTAAAAG
6、CTGTGGGTCTAAAGCTATACCAGTAACACCACCTATCGTCTGTGGGTCTCGTGTATGAGATCCTATAGTTTGATGATTGGTTGGTTTTA6 样本前处理与核酸提取6.1 样本样本为受试者尿液。6.2 样本采集6.2.1 登记受检者编号信息,将样本信息贴于洁净尿液收集容器上。6.2.2 采集受检者上午 10 点至下午 2 点之间的尿液,避免粪便污染,女性应避开生理期留取尿液样本。6.2.3 肉眼观察尿液颜色与性状(淡黄、带血或血尿等)并作记录,摇动混匀后采集尿液 5 mL10 mL,加盖密封保存。6.2.4 采集后应及时送检,室温下保存时间不超过 4 h;
7、不能及时送检的,应在 4 冷藏,保存时间不超过 24 h。6.3 核酸提取6.3.1 将采集的尿液移入离心管中,1500g 离心 5 min 或静置 15 min。6.3.2 倾倒或吸弃上清尿液,取 200 L 尿沉渣样本,使用体液核酸提取试剂盒,按照操作说明提取核酸。6.3.3 取 2 L 制备好的核酸样本进行检测,或保存至-20 备用。2DB32/T 456520237 核酸检测7.1 向含有 RAA 反应体系的 PCR 管(见附录 B)中加入 45.5 L 缓冲液。7.2 在反应管的管盖中加入 2.5 L 乙酸镁。7.3 将 2 L 阴性质控品加入反应管中作为阴性对照,然后将 2 L 待
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