DB15∕T 3151-2023 酶消化法制备奶牛乳腺上皮细胞及其RNA提取技术规程(内蒙古自治区).pdf
《DB15∕T 3151-2023 酶消化法制备奶牛乳腺上皮细胞及其RNA提取技术规程(内蒙古自治区).pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《DB15∕T 3151-2023 酶消化法制备奶牛乳腺上皮细胞及其RNA提取技术规程(内蒙古自治区).pdf(9页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、 ICS 65.020.30 CCS B 44 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 31512023 酶消化法制备奶牛乳腺上皮细胞及其 RNA 提取技术规程 Technical procedures for preparation by enzyme digestion method and RNA extraction of bovine mammary epithelial cells 2023-08-25 发布 2023-09-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 31512023 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分:标准化
2、文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会(SAM/TC 19)归口。本文件起草单位:内蒙古自治区农牧业科学院。本文件主要起草人:宋洁、王丽芳、胡耀、张腾龙、郭晨阳、钟华晨、刘嘉琳、杨健、狄彩霞、羿静、肖豆鑫、吴海霞、王春和、田志国、王利平、高新发、王晓辉、常月明、杨竹鸣、石文奎、褚文彬、马跃。DB15/T 31512023 1 酶消化法制备奶牛乳腺上皮细胞及其 RNA 提取技术规程 1 范围 本文件规定了奶牛乳腺上皮细胞培养及其RNA提取和质量鉴定的方法。本文件适用于型胶原酶法制备奶牛乳腺上皮细胞及其RNA提取和质量鉴定。2 规范性引用文件 本文件没有规范性引
3、用文件。3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。奶牛乳腺上皮细胞 bovine mammary epithelial cells 奶牛乳腺组织中唯一可以合成和分泌乳汁的高度分化的功能细胞。角蛋白-18 cytokeratin18(CK18)上皮细胞特有的标志蛋白。4 试剂和材料 试验试剂 DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、青链霉素混合液(含有10000 unit/mL青霉素和10000 ug/mL链霉素)、胰岛素转铁蛋白硒、氢化可的松、两性霉素B、表皮生长因子、胶原酶、0.25%胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)、磷酸盐缓冲液(PBS)、75%酒精、4%多聚甲醛、0.3%曲拉通(T
4、ritonX100)、5%正常山羊血清、兔抗角蛋白18抗体、山羊抗兔IgG、4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、甘油、TRNzol裂解液、氯仿、异丙醇、无水乙醇、ddH2O、西班牙琼脂糖、50TAE、DNA片段标准参照物(DNA Marker DL 5000)、通用电泳加样缓冲液(6Loading Buffer)、核酸染料、反转录试剂盒、实时荧光定量(RT-PCR)试剂盒。试剂配制 4.2.1 3PBS 缓冲液:1PBS 缓冲液(500 mL)中加入 3 mL 青链霉素混合液,4 低温保存。4.2.2 6PBS 缓冲液:1PBS 缓冲液(500 mL)中加入 6 mL 青链霉素混合液,4
5、 低温保存。DB15/T 31512023 2 4.2.3 型胶原酶(0.5%):称取 75 mg型胶原酶,在灭菌烧杯中加 15 mL PBS 缓慢吹打溶解,0.22 m 针式过滤器过滤,现配现用。4.2.4 氢化可的松(0.1 mg/mL):1 mg 氢化可的松溶于 1 mL 乙醇溶液中,充分混匀至粉末完全溶解,用 1PBS 定容至 10 mL,用 0.22 m 滤膜过滤后,按每管 1 mL 分装,封口冻存于-20。4.2.5 两性霉素 B(2.5 mg/mL):25 mg 两性霉素 B 粉末溶于 10 mL 三蒸水中,吹打溶解后用 0.22m 针式过滤器过滤,按每管 1 mL 分装,封口冻
6、存于-20。4.2.6 表皮生长因子(10 g/mL):将 0.1 mg 的表皮生长因子溶解在 10 mL 的 PBS 中,按每管 1 mL 分装,封口冻存于-20。4.2.7 完全培养基:将 90 mL DMEM/F12 培养基、10 mL FBS、4 mL 青链霉素、0.5 mL 胰岛素转铁蛋白硒、0.1 mL 氢化可的松(4.2.4)、0.1 mL 两性霉素 B(4.2.5)、10 L 表皮生长因子(4.2.6)加入250 mL 蓝盖瓶,混匀后 4 保存。4.2.8 消化终止培养基:8 mL DMEM/F12 培养基中加入 2 mL FBS 混匀,现配现用。4.2.9 细胞冻存液:8 m
7、L DMEM/F12 培养基中加入 1 mL FBS、1 mL DMSO 混匀,现配现用。4.2.10 1TAE:1 mL 50TAE 加 49 mL ddH2O,定容后混匀。4.2.11 琼脂糖凝胶(1%):250 mL 三角瓶中称 0.3000 g 琼脂糖,加入 30 mL 1TAE 缓冲液(4.2.10)。4.2.12 琼脂糖凝胶(2%):250 mL 三角瓶中称 0.6000 g 琼脂糖,加入 30 mL 1TAE 缓冲液(4.2.10)。试验材料 酒精灯、0.22 m针式过滤器、25 cm2透气细胞培养瓶、6孔细胞培养板、瓷盘、15 cm镊子、眼科镊、眼科剪、手术剪、5 mL无菌无酶
8、样品管、15 mL无菌无酶离心管、1.5 mL无菌无酶离心管、250 mL烧杯、250 mL蓝盖瓶、细胞冻存管、80目滤网、14 mm无菌细胞爬片、载玻片、无菌无酶枪头(10 L、200L、1 mL、5 mL)。仪器设备 天平(感量为0.0001 g)、生物安全柜、CO2培养箱、高压蒸汽灭菌锅、倒置显微镜、低速离心机(转速不低于1300 rpm)、高速冷冻离心机(转速不低于12000 rpm)、4 冰箱、-80 冰箱、酶标仪、凝胶成像仪、电泳仪、电泳槽、制胶板、移液枪、血细胞计数板。5 奶牛乳腺上皮细胞培养 原代培养 5.1.1 选取健康奶牛活体或屠宰后,采集色泽亮白的深层乳腺组织,迅速带回实
9、验室。5.1.2 将乳腺组织置于已用 75%酒精擦拭消毒的搪瓷盘中,去除乳腺表层组织,避开泌乳导管和结缔组织部位,剪取 1 cm3左右的深层腺泡,置于 6PBS 缓冲液(4.2.2)中浸泡 10 min,并清洗至溶液中无乳汁后,放入超净台。5.1.3 在超净台中点燃酒精灯,依次摆放 7 个 250 mL 灭菌烧杯,从左往右分别倒入 3 杯 150 mL 3PBS 缓冲液、1 杯 75%酒精、3 杯 3PBS 缓冲液(4.2.1)。5.1.4 用灭菌长柄镊子夹取组织块,按序在 7 个烧杯中清洗 30 s 后转移至无菌一次性培养皿中。5.1.5 在培养皿中再次剪去乳腺组织块表皮,剪取约 2 mL
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- DB15T 3151-2023 酶消化法制备奶牛乳腺上皮细胞及其RNA提取技术规程内蒙古自治区 DB15 3151 2023 消化 法
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【曲****】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【曲****】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。
链接地址:https://www.zixin.com.cn/doc/432094.html