SC∕T 3060-2023 鳕鱼品种的鉴定 实时荧光PCR法.pdf
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1、2023?04?11发布2023?08?01实施鳕鱼品种的鉴定实时荧光PCR法20中华人民共和国水产行业标准备案号:XXXX-XXXX67.120.30CCS X30602023Identification of cod fish speciesReal-time PCR methodSC中华人民共和国农业农村部发 布学兔兔 标准下载S C/T 前言本文件按照G B/T 标准化工作导则第部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出.本文件由全国水产标准化技术委员会水产品加工分技术委员
2、会(S A C/T C /S C)归口.本文件起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所、日照健安检测技术服务有限公司、荣成泰祥食品股份有限公司、山东时进检测服务有限公司.本文件主要起草人:姚琳、王联珠、曲梦、江艳华、郭莹莹、朱文嘉、柳淑芳、谭志军、张廷翠、杨青、李娜、蒋昕、毕迎斌.学兔兔 标准下载S C/T 鳕鱼品种的鉴定实时荧光P C R法范围本文件描述了以实时荧光P C R法测定鳕鱼源性成分的原理、仪器设备、试剂和材料、样品制备、D NA提取、D NA纯度和浓度测定、测定方法、结果判定与表达、防污染措施.本文件适用于鳕鱼及易混鱼产品的定性检测.包括太平洋鳕鱼(G a d u sm a c
3、 r o c e p h a l u s)、大西洋鳕鱼(G a d u sm o r h u a)、黑线鳕(M e l a n o g r a mm u s a e g l e f i n u)、绿青鳕(P o l l a c h i u s v i r e n s)、蓝鳕(M i c r o m e s i s t i u sp o u t a s s o u)、细鳞壮鳕(A l b a t r o s s i ap e c t o r a l i s)、狭鳕(T h e r a g r ac h a l c o g r a mm a)、阿根廷无须鳕(M e r l u c c i u sh
4、 u b b s i)等鳕鱼,以及棘鳞蛇鲭(R u v e t t u sp r e t i o s u s)、异鳞蛇鲭(L e p i d o c y b i u mf l a v o b r u n n e u m)、小鳞南极犬牙鱼(D i s s o s t i c h u se l e g i n o i d e s)、莫氏南极犬牙鱼(D i s s o s t i c h u sm a w s o n i)、裸盖鱼(A n o p l o p o m af i m b r i a)等鳕鱼易混品种.本文件不适用于混合样品.规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必
5、不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.G B/T 分析实验室用水规格和试验方法G B/T 转基因产品检测实时荧光定性聚合酶链式反应(P C R)检测方法G B/T 实验室质量控制规范食品分子生物学检测术语和定义G B/T 界定的术语和定义适用于本文件.缩略语下列缩略语适用于本文件.B S A:牛血清蛋白(b u l l s e r u ma l b u m i n)C O:细胞色素氧化酶亚基(c y t o c h r o m eo x i d a s es u b u n i t)C T A B:
6、十六烷基三甲基溴化铵(c e t y l t r i t h y l a mm o n i u mb r o m i d e)C t:循环阈值(c y c l e t h r e s h o l d)C y tb:细胞色素b(c y t o c h r o m eb)D NA:脱氧核糖核酸(d e o x y r i b o n u l e i ca c i d)D N a s e:脱氧核糖核酸酶(d e o x y r i b o n u c l e a s e)d AT P:脱氧腺苷三磷酸(d e o x y a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t
7、e)d C T P:脱氧胞苷三磷酸(d e o x y c y t i d i n e t r i p h o s p h a t e)d G T P:脱氧鸟苷三磷酸(d e o x y g u a n o s i n e t r i p h o s p h a t e)d NT P:脱氧核苷酸三磷酸(d e o x y r i b o n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e)d T T P:脱氧胸苷三磷酸(d e o x y t h y m i d i n e t r i p h o s p h a t e)E D T A:乙二胺四乙酸(e t
8、 h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d)F AM:羧基荧光素(c a r b o x yf l u o r e s c e i n)I U:酶活国际单位(i n t e r n a t i o n a lu n i t)MG B:小沟结合物(m i n o rg r o o v eb i n d e r)P C R:聚合酶链式反应(p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n)学兔兔 标准下载S C/T R O X:羧基 X 罗丹明(c a r b o x y X r h o d a
9、 m i n e)S N P:单核苷酸多态性(s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m)T a q:水生栖热菌(T h e r m u sa q u a t i c u)T r i s:三(羟甲基)氨基甲烷t r i s(h y d r o x y m e t h y l)a m i n o m e t h a n e S r R NA:S核糖体R NA(Sr i b o s o m a lR NA)S r R NA:S核糖体R NA(Sr i b o s o m a lR NA)鳕鱼及其易混品种 鳕鱼本文件中指鳕形目(G a
10、d i f o r m e s)鱼类,主要指商业化捕捞、加工与贸易中常见的鳕科(G a d i d a e)、长尾鳕科(M a c r o u r i d a e)、无须鳕科(M e r l u c c i i d a e)的主要品种.油鱼本文件中指鲈形目带科棘鳞蛇鲭属的棘鳞蛇鲭(R u v e t t u sp r e t i o s u s)及异鳞蛇鲭属的异鳞蛇鲭(L e p i d o c y b i u mf l a v o b r u n n e u m).切片后商品形态与鳕鱼类似,市场俗称油鱼.银鳕鱼本文件中指商业化捕捞、加工与贸易中常见的鲈形目南极鱼科犬牙南极鱼属的小鳞南极犬牙鱼
11、(D i s s o s t i c h u s e l e g i n o i d e s)、莫氏南极犬牙鱼(D i s s o s t i c h u sm a w s o n i),鲉形目黑鲉科裸盖鱼属的裸盖鱼(A n o p l o p o m af i m b r i a),市场俗称银鳕鱼.裸盖鱼也俗称黑鳕鱼.原理针对鳕鱼及其易混品种的特异性基因片段设计引物与探针,通过分析实时荧光P C R扩增曲线与C t值,对鳕鱼及其易混品种进行定性判定.仪器设备 实时荧光P C R仪.离心机:转速不小于 r/m i n.核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计.天平:感量 g.恒温水浴锅.高压灭菌锅.涡旋
12、振荡器.微量移液器.试剂和材料除另有规定外,所用试剂均为分析纯;实验用水为G B/T 中规定的一级水;所用试剂、材料均应不含D NA和D N a s e.试剂 苯酚.浓盐酸.氯仿.异戊醇.异丙醇.无水乙醇.学兔兔 标准下载S C/T C T A B.氯化钠.T r i s b a s e.N aE D T A.蛋白酶K:I U/m g.热启动T a qD NA聚合酶:I U/L.氯化钾.硫酸铵.七水硫酸镁.T r i t o nX .B S A.d NT P.d AT P.d C T P.d G T P.d T T P.R O X.溶液 mm o l/L氯化钾溶液:用 m L水溶解 g氯化钾(
13、)并定容至 m L,高压灭菌.mm o l/L硫酸铵溶液:用 m L水溶解 g硫酸铵()并定容至 m L.mm o l/L硫酸镁溶液:用 m L水溶解 g七水硫酸镁()并定容至 m L,高压灭菌.mm o l/LT r i s HC l溶液:用 m L水溶解 gT r i s b a s e(),用浓盐酸()调p H至 ,用水定容至 m L,高压灭菌.mm o l/Ld AT P溶液:取 gd AT P(),用水溶解并定容至 m L.mm o l/Ld C T P溶液:取 gd C T P(),用水溶解并定容至 m L.mm o l/Ld G T P溶液:取 gd G T P(),用水溶解并定
14、容至 m L.mm o l/Ld T T P溶液:取 gd T T P(),用水溶解并定容至 m L.mm o l/Ld NT P溶液:取 m L mm o l/Ld AT P溶液()、m L mm o l/Ld C T P溶液()、m L mm o l/Ld G T P溶 液()与 m L mm o l/Ld T T P溶 液()混匀.乙醇:量取 m L无水乙醇()与 m L水混匀.苯酚氯仿异戊醇混合液:量取 m L苯酚()、m L氯仿()与m L异戊醇()混匀,静置 h.T r i t o nX 溶液:取 LT r i t o nX ()与 m L水混匀.m g/m LB S A溶液:取
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