NY∕T 537-2023 (代替 NY∕T 537-2002)猪传染性胸膜肺炎诊断技术.pdf
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1、2023?02?17发布2023?06?01实施猪传染性胸膜肺炎诊断技术41中华人民共和国农业行业标准备案号:XXXX-XXXX11.220CCS B5372023Diagnostic techniques for porcine contagious pleuropneumonia中华人民共和国农业农村部发 布代替 NY/T?5372002学兔兔 标准下载N Y/T 前言本文件按照G B/T 标准化工作导则第部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草.本文件代替NY/T 猪放线杆菌胸膜肺炎诊断技术.与NY/T 相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下:a)增加了“缩略语”(见第章)
2、;b)增加了“临床诊断”(见第章);c)增加了“P C R检测”(见第章);d)增加了“实时荧光P C R检测方法”(见第章);e)增加了“综合结果判定说明”(见第 章);f)增加了“胸膜肺炎放线杆菌形态图”(见附录B);g)删除了“补体结合试验”(见 年版的第章);h)修改了“酶联免疫吸附试验”(见第 章,年版的第章).请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担专利的责任.本文件由农业农村部畜牧兽医局提出.本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(S A C/T C )归口.本文件起草单位:中国动物卫生与流行病学中心、河南科技大学、江苏省农业科学院、广西壮族自治区动物疫病预防控制
3、中心、山东畜牧兽医职业学院、青岛市即墨区畜牧业发展服务中心.本文件主要起草人:魏荣、张慧、周俊明、汪洋、盖文燕、徐天刚、刘丽蓉、孙翔翔、王岩、魏甜甜、董雅琴、刘爽、倪艳秀、吴发兴、何奇松、熊毅.本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为:年首次发布为NY/T ;本次为第一次修订.学兔兔 标准下载N Y/T 引言猪传染性胸膜肺炎(p o r c i n ep l e u r o p n e u m o n i a)是由胸膜肺炎放线杆菌引起的一种猪的急性呼吸道传染病.发病猪以急性出血性纤维素性肺炎和慢性纤维素性坏死性胸膜炎为主要特征.急性病例病死率高,慢性病例能耐过,表现出消瘦和生长发育不良.目前,
4、该病在世界上养猪国家广泛存在.胸膜肺炎放线杆菌(A c t i n o b a c i l l u sp l e u r o p n e u m o n i a e,A P P)属于巴氏杆菌科放线杆菌属.根据对辅酶(NA D)的依赖性,分为生物型和生物型;根据荚膜多糖及脂多糖的抗原性差异,目前将本菌分为 个血清型.通常、型为生物型,生物需要依赖NA D,大多数 型和 型属于生物型,生长不依赖NA D.不同血清型甚至同一血清型中不同菌株之间的毒力有差异,一般型、型、型及 型毒力最强,型、型、型、型、型及 型为中等毒力或低毒力.我国A P P主要流行血清型为型、型、型、型、型、型.学兔兔 标准下载
5、N Y/T 猪传染性胸膜肺炎诊断技术范围本文件规定了猪传染性胸膜肺炎临床诊断、样品采集和运送、病原分离与鉴定、P C R检测、实时荧光P C R检测、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验的技术要求和规范.本文件适用于猪传染性胸膜肺炎的诊断、检疫、检测、监测和流行病学调查等.规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.NY/T 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范术语和定义下列术语和定义适用于本文件.卫星现象S a t e l l i t ep h
6、e n o m e n o n挑取A P P菌落接种于血琼脂表面,用金黄色葡萄球菌点种或垂直划线,在 C O条件下培养 h h.越靠近金黄色葡萄球菌菌落生长的本菌菌落越大,越远的越小甚至不见菌落生长,即所谓“卫星现象”,也称V因子需要试验.溶血 h e m o l y s i s菌落周围形成完全透明的溶血环,红细胞完全溶解,称为溶血.相对的,在菌落周围形成不透明的草绿色溶血环,红细胞未溶解,血红蛋白变成绿色,称为溶血.胸膜肺炎放线杆菌含重复子毒素A c t i n o b a c i l l u sp l e u r o p n e u m o n i a eR T X,A p xA P P可
7、产生种毒素,分别为A p x、A p x、A p x、A p x,均为重要的毒力因子,具有细胞毒性或溶血性,是一种穿孔毒素,属于含重复子毒素(r e p e a t s i nt o x i n,R T X)家族.其中,A p x存在于所有血清型,且只在猪体内产生.缩略语下列缩略语适用于本文件.A P P:胸膜肺炎放线杆菌(A c t i n o b a c i l l u sp l e u r o p n e u m o n i a e)P B S:磷酸盐缓冲液(P h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n eb u f f e r)T S B:胰蛋白
8、大豆肉汤(T r y p t i c a s es o yb r o t h)NA D:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,也称V因子(N i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d e)C AMP:协同溶血试验(C h r i s t i s A t k i n s M u n c h p e t e r s o n)A p x:胸膜肺炎放线杆菌含重复子毒素(A c t i n o b a c i l l u sp l e u r o p n e u m o n i a eR T X)P C R:聚合酶链式反应(P o l y m e r
9、 a s ec h a i nr e a c t i o n)D NA:脱氧核糖核酸(D e o x y r i b o n u c l e i ca c i d)d NT P:脱氧核糖核苷三磷酸(D e o x y r i b o n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e)T E:T r i s E D T A缓冲液(T r i s E D T Ab u f f e r)学兔兔 标准下载N Y/T T A E:T A E缓冲液(T r i s a c e t i c E D T Ab u f f e r)E L I S A:酶联免疫吸附试验(E
10、n z y m e l i n k e d i mm u n es o r b e n t a s s a y)HR P:辣根过氧化物酶(H o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e)TMB:,四甲基联苯胺(,T e t r a m e t h y l b e n z i d i n e)I P T G:异丙基 D 硫代半乳糖苷(I s o p r o p y l b e t a D t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e)临床诊断 流行病学 易感动物对猪具有高度宿主特异性,各年龄猪均易感.传染源带菌猪、病猪及其分
11、泌物是本病的传染源.病菌主要存在于肺脏病变部位、扁桃体、支气管、鼻分泌物中.传播途径主要传播途径是通过猪与猪的直接接触或短距离飞沫传播.流行特点一年四季均可发生,秋末春初季节变化时多发.饲养环境突然改变、密集饲养、通风不良、气候突变及长途运输等诱因可引起本病.猪场或猪群之间的传播,多由引进或混入带菌猪、慢性感染猪所致,集约化猪场往往呈跳跃式急性暴发,死亡率高.临床症状 最急性型本病临床症状因动物的年龄、免疫状态、疫病状态、环境因素及对病原的易感程度等不同而呈现差异.猪群中一头或几头猪只突然发病.体温升高达 ,并可出现短期呕吐.鼻、耳、眼及后躯皮肤常发绀,最后阶段出现严重呼吸困难,临死前常从口、
12、鼻流出血性泡沫状分泌物.有时未见任何症状即突然死亡.急性型病猪体温升高,可达 ,精神委顿,喜卧少动,饮食不振.有咳嗽、喘气、呼吸困难等严重呼吸道症状.亚急性型或慢性型病猪体温可能无明显变化,常呈现间歇性咳嗽,呼吸异常、食欲不振、增重减少.疾病暴发初期,母猪常出现流产(可能由发热引起).个别猪只出现中耳炎.若混合感染猪流感病毒、巴氏杆菌、支原体等其他呼吸道病原时,病程恶化,病死率明显增加.病理特征 剖检后的眼观变化主要是纤维素性肺炎,可呈单侧、双侧、大叶性、弥漫性或多灶性,肺炎区色深,有出血点或斑块状出血,中等硬度,略有弹性,急性、亚急性和慢性病例可见肺部纤维素性渗出物.纤维素性胸膜炎明显,急性
13、和慢性病例均可见胸腔含有带血色的液体,胸膜有粘连区,气管和支气管充满带血色的黏液性泡沫分泌物.组织学变化以肺组织坏死、出血、中性粒细胞浸润、血管栓塞、广泛水肿和纤维素性渗出为特征,坏死区周围发生巨噬细胞浸润和纤维化.结果判定易感动物出现 或 或 至少一项临床症状且符合 流行病学及 病理特征,判定为A P P感染疑似病例.学兔兔 标准下载N Y/T 样品采集和运送 耗材 无菌棉拭子.灭菌管.医用防护服.试剂 P B S,按照附录A中A 描述的方法配制.甘油磷酸盐缓冲液,按照A 描述的方法配制.活体病料采集按照NY/T 规定的方法采样.用棉拭子伸入鼻腔采集分泌物,将该鼻拭子样品端置于含有m LP
14、B S或 甘油磷酸盐缓冲液的灭菌管中.尸体病料采集无菌采集具有典型病变的肺、肺门淋巴结、扁桃体、气管或鼻腔分泌物.最急性感染死亡的病猪,除采集上述病料外,还可取脾、血液病料,置于无菌密封袋或密封容器中.样品运送按照NY/T 规定的方法运输.采集的样品,在条件下保存时间应不超过 h.病原分离与鉴定 仪器设备和耗材 生物安全柜.C O恒温培养箱.光学显微镜.微量可调移液器(L L、L L、L L和 L L各支).m L无菌试管.吸头.接种环.试剂 血琼脂,按照A 描述的方法配制.巧克力琼脂,按照A 描述的方法配制.T S B,按照A 描述的方法配制.商品化革兰染色试剂.NA D储存液,按照A 描述
15、的方法配制.商品化新生牛血清.尿素琼脂,按照A 描述的方法配制.商品化微量生化鉴定管(D 木糖、甘露醇、棉子糖、阿拉伯胶糖等).分离培养在生物安全柜中用接种环无菌蘸取采集的样品划线接种于血琼脂表面,再用金黄色葡萄球菌作交叉划线,在 C O条件下培养 h h,形成菌落后依据 鉴定.培养特性 菌落特性A P P为黏液型的小菌落,直径 mmmm.多数菌株可产生稳定的溶血.生物型A P P依学兔兔 标准下载N Y/T 赖NA D,包括 血清型、血清型,不能在血琼脂上生长,可在含有NA D或由共培养的葡萄球菌提供NA D的血琼脂上生长,产生“卫星现象”.生物型不依赖NA D,包括 血清型和 血清型,可在
16、血琼脂上生长,不产生“卫星现象”.卫星现象挑取A P P菌落接种于血琼脂表面,用金黄色葡萄球菌点种或垂直划线,在 C O条件下培养 h h.越靠近金黄色葡萄球菌菌落生长的本菌菌落越大,越远的越小甚至不见菌落生长,即所谓“卫星现象”,也称V因子需要试验(见附录B中的B ).涂片染色镜检取典型菌落作革兰染色,镜检显示为革兰阴性小球杆菌,两极着色(见B ).增殖培养在生物安全柜中挑取溶血或具有“卫星现象”的典型单菌落在巧克力琼脂上进行再次纯培养后,挑取单个菌落接种于添加 新生牛血清和 g/m LNA D的T S B液体培养基中,培养 h h至液体混浊.生化鉴定 尿素酶试验将分离菌接种于尿素琼脂斜面上
17、,置于 C O恒温培养箱中培养h h,斜面变粉红色者为尿素酶试验阳性,否则为阴性.C A M P试验在血琼脂上用具有溶血的金黄色葡萄球菌划一横线,在此横线下方隔 c m c m处划垂直线接种被检菌,置于 C O恒温培养箱中培养 h,横线与垂直线相邻空间的溶血区明显增大者为阳性,否则为阴性.糖发酵试验将少量待检菌接种于糖发酵管培养液内,置于 C O恒温培养箱中培养 h h,能分解某种糖会产酸或产酸产气.产酸时,可使颜色变黄,产气者于倒置小发酵管内出现气泡.发酵D木糖、甘露醇,不发酵棉子糖、阿拉伯胶糖者为阳性,否则为阴性.核酸鉴定对符合 的分离菌株,选用P C R检测(见第章)或实时荧光P C R
18、检测(见第章)进行核酸鉴定.血清型鉴定对符合 的分离菌株,可用琼脂扩散实验(见第 章)进行血清型鉴定.结果判定病原分离培养形成的菌落符合A P P培养特性、染色特征、生化特性且核酸阳性者,判定A P P分离阳性.P C R检测 仪器设备和耗材 组织匀浆器或研钵.生物安全柜.冷冻离心机.恒温水浴锅.P C R扩增仪.稳压稳流电泳仪和水平电泳槽.凝胶成像系统或紫外透射仪.学兔兔 标准下载N Y/T 微量可调移液器(L L、L L、L L和 L L各支).吸头.P C R管.m L无菌离心管.试剂 P B S,按照A 描述的方法配制.消化液和消化液,按照A 描述的方法配制.酚/氯仿/异戊醇混合液,按
19、照A 描述的方法配制.乙醇.T E缓冲液,按照A 描述的方法配制.商品化P C R反应试剂盒.T A E电泳缓冲液,按照A 描述的方法配制.商品化上样缓冲液.琼脂糖.D NA相对分子量标准物M a r k e rD L .无菌双蒸水(d d HO).阴、阳性对照:分别为灭菌的T S B培养基和灭活的A P P菌株.上、下游引物:按照附录C中C 的描述合成.样品处理 组织样品用无菌剪刀和镊子剪取典型病变组织 g g,加入 m Lm LP B S,于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨,将组织悬液转入无菌离心管中备用.鼻及气管分泌物鼻拭子在 mLmLP B S中反复挤压,r/m i n离心m i n,
20、沉淀用 LP B S重悬备用.增菌培养物按照 所述方法进行病原分离培养,并吸取增菌培养物 L于无菌离心管中,r/m i n离心m i n,沉淀用 LP B S重悬备用.组织样品D N A的制备 分别取上述处理后样品、阴性对照、阳性对照各 L,加入到 m L无菌离心管,再在每管中加入 L消化液和 L消化液,反复吹打混匀,置于 条件下水浴 m i n m i n.分别加入 L酚/氯仿/异戊醇混合液,混匀,于条件下 r/m i n离心 m i n,分别吸取离心后的上层清液转移至新的 m L无菌离心管中.加入等体积 预冷的异丙醇,混匀,室温放置 m i n,条件下 r/m i n离心 m i n,轻轻
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