DB31∕T 955-2022 猪圆环病毒3型实时荧光PCR检测方法(上海市).pdf
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1、ICS 11.220CCS B 41上海市地方标准DB31/T 9552022代替 DB31/T 9552015猪同环病毒3型实时荧光PCR检测方法Real-time PCR method for detection of porcine circovirus type 32022-11-09 发布2023-02-01 实施 发布 出版中国标准.上海市市场监督管理局DB31/T 9552022目 次前言.田1 范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14原理.15仪器设备.16耗材.27试剂.28样品采集与处理.29 DNA提取.310 实时荧光PCR检测.3附录A(规范性)溶液配制.5附录
2、B(规范性)引物和探针.6附录C(规范性)DNA提取方法.7附录D(规范性)荧光PCR反应体系.8DB31/T 9552022前 言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件代替DB31/T 9552015猪圆环病毒2a/2b亚型实时荧光PCR检测和分型方法,与 DB31/T 9552015相比,除编辑性改动外,主要技术变化如下:更改“缩略语”为“术语和定义”(见第3章,2015年版的第3章);增加了耗材(见第6章);更改了试剂(见第7章,2015年版的第6
3、章);增加了粪便样品采集方法(见第8章);删除了注意事项(见2015年版的第9章);更改了附录A(见附录A.2O15年版的第6章);增加了引物和探针(见附录B);更改了 DNA提取方法(见附录C.2015年版的附录A);增加了荧光PCR反应体系(见附录D)。本文件由上海市农业农村委员会提出并组织实施。本文件由上海市畜牧业标准化技术委员会归口。本文件起草单位:上海市动物疫病预防控制中心.本文件主要起草人:刘健、杨德全、葛菲菲、李鑫、白艺兰、沈海潇、赵洪进、王建、杨显超、周锦萍、鞠厚斌、李凯航、卢军、葛杰、桂亚萍。本文件所代替文件的历次版本发布情况为:-DB31/T 9552015 oinDB31
4、/T 9552022猪圆环病毒3型实时荧光PCR检测方法1范围本文件规定了猪圆环病毒3型实时荧光PCR检测方法的仪器设备、耗材、试剂、样品采集与处理、DNA提取和实时荧光PCR检测等技术要求。本文件适用于猪圆环病毒3型核酸检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试睑方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1猪圆环病毒 3 型 porcine circovirus type 3;PC
5、V3属于圆环病毒科圆环病毒属新发猪病毒性传染病病原,表现为猪皮炎与肾病综合征的临床病症。3.2开放阅读框 open reading frame;ORF从起始密码子开始,是DNA序列中具有编码蛋白质潜能的序列,结束于终止密码子连续的碱基 序列。3.3循环数阈值 cycle threshold valueCt值每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。4原理根据PCV3 ORF1序列,设计相应的引物和探针,建立实时荧光PCR检测方法。5仪器设备5.1 荧光PCR仪。5.2 研钵或组织研磨器。5.3 干热灭菌器。5.4 高速台式冷冻离心机:可控温至4,离心力可达12 000 r/min
6、以上。1DB31/T 95520225.5 水浴锅。5.6 普通冰箱:298匕。5.7 普通冰箱:一 181c以下。5.8 超低温冰箱:一70七以下。5.9 可调移液器:0.2 ML-2 mL05.10 可调移液器:0.5 PL1O mLo5.11 可调移液器:10 fL100 PLO5.12 可调移液器:20耳200山。5.13 可调移液器:100 rL1 0005.14 涡旋混匀器。5.15 高压灭菌锅。5.16 冰盒:一18 以下预冷。6耗材6.1 1.5 mL无菌离心管。6.2 0.2 mLPCR光学反应管。6.3 与可调移液器匹配的吸头。7成剂7.1 除特别说明以外,在检测中使用的试
7、剂均为分析纯,实验室用水应符合GB/T 6682的要求。7.2 磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L PBS,pH 7.4),按附录A中A.1进行配制。7.3 DNAzol,商品化DNA抽提试剂,于2七8七保存。7.4 无水乙醇,一 18七以下预冷。7.5 75%乙醇,无水乙醇和灭菌去离子水配制,一18七以下预冷。7.6 2XPCR施预混液,按A.2配制,也可用等效的商品化预混液。7.7 引物和探针,其序列按照附录B合成。7.8 PCV3阳性对照和阴性对照:阳性对照使用组织培养灭活毒,一18七以下保存备用;阴性对照可采 用健康猪的组织材料。8样品采集与处理8.1 采样工具8.1.1 手术刀、剪子
8、、镒子,经160匕干热灭菌2 h。8.1.2 研钵或组织研磨器,经160七干热灭菌2 h。8.1.3 真空采血管。8.1.4 EDTA真空抗凝管。8.1.5 无菌棉拭广。8.1.6 5 mL无菌离心管。8.1.7 15 mL无菌离心管。2DB31/T 95520228.2 样用采集8.2.1 血清样品:用真空采血管采集受检猪静脉血2 mL,室温或者37 倾斜放置自然凝集20 min 30 min,2 000 r/min离心5 min,吸取不少于0.5 mL上清液至1.5 mL无菌离心管内备用。8.2.2 全血样品:用EDTA真空抗凝管采集受检猪静脉血2 mL,吸取1 mL全血置于1.5 mL无
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