基于GC-MS的代谢组学方法筛选辐射生物剂量血浆标志物的初步研究济.pdf
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1、 硕士学位论文论文题目基于GC-MS的代谢组学方法筛选辐射生物剂量血浆标志物的初步研究_ 基于GC-MS的代谢组学方法筛选辐射生物剂量血浆标志物的研究中文摘要中文摘要核战争和灾难性核事故的发生会造成大量伤员,在对此类伤员的紧急医学救 治中,早期、快速检测伤员受照剂量的大小,是合理利用有限医疗资源,科学制 定救治策略,提高救治效率和存活率的关键环节。本文探索性地运用基于气相色 谱-质谱联用(GC-MS)的代谢组学方法,筛选出潜在的辐射生物剂量标志物,并 将其用于辐射伤情分类的研究。止匕外,对这些代谢标志物的生物学意义以及关键 代谢通路进行了初步探讨。本研究为发展快速、简便、灵敏和准确的电离辐射生
2、 物剂量计以及揭示急性电离辐射损伤和修复的分子机制提供了实验依据。1.建立了基于GC-MS联用技术的血浆代谢物分析方法。以N-0-双(三甲硅 基)三氟乙酰胺(MSTFA)-两步衍生法为基础,对样品制备方法(如萃取剂的选 择、萃取剂用量、衍生化条件)和GC-MS分析条件(如升温程序条件)进行了优 化。此外,对包括精密度、重现性及稳定性在内的分析方法特性进行了考察。在 此基础上,将NIST质谱数据库搜索和标准品验证相结合完成对血浆代谢物的结构 鉴定。2.利用建立的GC-MS血浆代谢物分析方法,从剂量效应(OGy,2Gy,4Gy,6Gy,8Gy)考察了不同时间点(辐射后5h,24h,48h和72h)
3、电离辐射对大鼠血 浆代谢物的影响,进行辐射损伤伤情分类的研究并筛选出潜在的辐射生物剂量标 志物,辐射生物剂量血浆标志物的筛选是利用遗传算法与随机森林相结合。结果 表明,辐射后5 h、48h及72h的伤情分类均为100%,24h除轻度伤情分类为92%外,其余均为100%。3.将不同时相点筛选的生物标志物进行相关性分析,探讨其生物学意义以及 涉及的关键代谢通路,辐射损伤所扰动的代谢通路主要包括氨基酸代谢、能量代 谢及脂类代谢。关键词:电离辐射;代谢组学;气象色谱-质谱联用;辐射生物剂量标志物;伤情分类 英文摘要基于GC-MS的代谢组学方法筛选辐射生物剂量血浆标志物的研究Preliminary st
4、udy of the radiation biological dose estimation plasma markers based on GC-MS metabolomicsAbstractRapid r adiatio n in jur y ear ly tr iage af ter a r adio lo gic al o r n uc lear expo sur e is vital f o r tr eatmen t o f a lar ge n umber o f wo un ded peo ple an d limited medic al r eso ur c es all
5、o c atio n,it is c r itic al f o r impr o vin g th e tr eatmen t an d sur vival ef f ic ien c y.Her e,a metabo lo mic meth o ds based o n gas c h r o mato gr aph y-mass spec tr o meter(GC-MS)was develo ped f o r th e an aly sis o f plasma metabo lic ph en o ty pe c h an ges in r at bo dy explo r ato
6、 r y an d selec t th e po ten tial r adiatio n bio mar ker s.Fin ally,th e r adiatio n in jur y tr iage was studied c o mbin ed with n o n-lin ear ker n el par tial least squar es(KPLS).In additio n,th e bio lo gic al sign if ic an c e an d r elevan t metabo lic path way s o f th ese bio mar ker s w
7、er e explo r ed.Th e f in din gs pr o vide exper imen tal eviden c e f o r develo pin g f ast,simple,sen sitive an d ac c ur ate r adiatio n bio do simetr y an d un der stan din g th e path o gen esis o f r adiatio n in jur y an d r epair.1)A GC-MS meth o d was develo ped to an aly ze plasma metabo
8、lites.Based o n th e two step der ivative o f MSTFA,th e sample pr epar atio n pr o c ess(suc h as th e selec tio n o f extr ac tio n so lven t,th e do sage o f extr ac tio n so lven t an d th e der ivatizatio n c o n ditio n)an d GC-MS an aly sis c o n ditio n s in c ludin g temper atur e pr o gr a
9、ms wer e o ptimized.In additio n,th e an aly sis meth o d c h ar ac ter istic s in c ludin g pr ec isio n,r epr o duc ibility an d stability wer e in vestigated.With th e NIST mass spec tr al database,th e plasma metabo lites wer e c o n f ir med by c o mpar in g with th e stan dar d spec tr o metr
10、y.2)Th e GC-MS plasma metabo lites meth o d was applied to in vestigate th e ef f ec ts o f io n izin g r adiatio n o n r at plasma metabo lites f r o m th e do se-r espo n se ef f ec t af ter dif f er en t time po in ts(5h,24h,48h an d 72h)po st-expo sur e.Co mbin ed with th e KPLS mo del,th e r ad
11、iatio n in jur y tr iage was studied.Th e c lassif ic atio n ac c ur ac y o f all levels o f r adiatio n in jur y was all ac h ieved 100%at 5h,48h an d 72h exc ept th at o f 24h with abo ve 92%c lassif ic atio n ac c ur ac y.Mo r eo ver,th e po ten tial r adiatio n bio lo gic al do se estimatio n ma
12、r ker s wer e sc r een ed based o n gen etic algo r ith m(GA)an d r an do m f o r est(RF)f eatur eii基于GC-MS的代谢组学方法筛选辐射生物剂量血浆标志物的研究英文摘要meth o d.3)Th e bio lo gic al sign if ic an c e an d th e key metabo lic path way s in vo lved in th ese po ten tial r adiatio n bio lo gic al do se estimatio n mar k
13、er s wer e explo r ed.Th e per tur bed metabo lic path way s in r espo n se to r adiatio n damage in c luded amin o ac id metabo lism,en er gy metabo lism an d lipid metabo lism.Key words:io n izin g r adiatio n,Metabo n o mic s,GC-MS,bio mar ker s,tr iage,Wr itten by:Zh an g Yuan y uanSuper vised b
14、y:Wan g Ch an gill目录序言.1第一章 基于GC-MS联用技术血浆代谢物分析方法的建立.51.1 引言.51.2 实验部分.51.3 结果与讨论.71.4 本章小结.17第二章辐射生物剂量标志物的筛选和早期伤情分类的研究.192.2 实验部分.192.3 结果与讨论.212.4 小结.34第三章辐射生物剂量标志物的生物学意义及代谢通路探讨.383.1 引言.383.2 实验部分.383.3 结果与讨论.393.4 小结.44全文总结与展望.51综述:辐射代谢组学研究进展.52攻读硕士学位期间发表的论文.62致谢.66基于GC-MS的代谢组学方法筛选辐射生物剂量血浆标志物的研究序
15、言序言核战争、核恐怖和放射性核事故会导致大量人员在短时间内受伤,对大规模 受照人群的辐射剂量的评估日益受到国内外的关注。在电离辐射事故发生后,应 快速、准确地估算人员所受的剂量,为伤员病情判断、治疗措施的选择、预后诊 断和事故分级提供依据。同时,伤员的快速伤情分类对于有限医疗资源的合理利 用和科学制定救治策略亦具有重要的意义。近年来国内外已经得到应用的电离辐 射生物剂量估算方法主要集中在细胞遗传学和体细胞基因突变上。然而这些生物 剂量估计指标在应用上都面临方法复杂、过程繁琐、时间较长等问题,很难满足 快速剂量估算的要求。此外,这些生物剂量方法都是通过单个变量(或指标)进 行辐射损伤估计,单变量
16、分析简单易行,但对于复杂的生物体系来说,很难找到 一个对辐射损伤既灵敏又专一的单个变量或单个标志物,这导致这些传统的生物 剂量估剂方法都有其固有的局限性和不确定性叫因此,辐照事故发生后,将多 个生物剂量估算指标用于剂量估算已经引起研究人员的重视。代谢组学是关于定量描述某一生物或细胞在特定生理时期内源性代谢物质的 整体及其对内因和外因变化应答规律的一门科学,是系统生物学的重要组成部分 叫在过去几十年,代谢组学方法作为生物医学数据的来源,其应用变得日益普遍。代谢组学已被广泛用于研究心血管疾病、肿瘤等多种疾病的发病机制和筛选与 诊断相关的生物标志物并取得一定的进展。电离辐射可引发复杂的分子和细胞的
17、反应网络,影响代谢过程,并改变机体代谢小分子的水平。近年来,代谢组学开 始用于辐射生物剂量标志物的研究纥例如,识别丫一射线尿液代谢标志物的研究 已见报道。因此,发展和应用代谢组学方法寻找估算大量人群受照剂量的生物 标志物的研究将极具前景。这就是所谓的“辐射代谢组学”:通过研究电离辐射暴露 导致的机体代谢物的变化,对机体受到的辐射损伤进行剂量估算。气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术从上世纪70年代开始兴起,被广泛应用 于植物、药物开发及疾病等多个研究领域W一。由于毛细管色谱柱的使用提供了 强大的色谱分离效能以及EI(电子离子)源标准谱图库为代谢物结构鉴定提供的 便利,GC-MS成为目前代谢组学
18、研究的主流平台之一 2。-2引。1序言 基于GCMS的代谢组学方法筛选辐射生物剂量血浆标志物的研究本研究以Wistar大鼠为研究对象,运用基于气相色谱-质谱联用(GC-MS)的 代谢组学方法,筛选出潜在的辐射生物剂量标志物,并将其用于辐射伤情分类的 研究。止匕外,对这些代谢标志物的生物学意义以及涉及的关键代谢通路进行了初 步探讨。该研究结果为发展快速、简便、灵敏和准确的电离辐射生物剂量计以及 揭示急性电离辐射损伤和修复的分子机制提供了实验依据。2Luec keH,Go n zalezFJ,BlakelyWF,IdleJR.Radiatio nmetabo lo mic s.5.Iden tif
19、 ic atio n9Jo h n so nCH,Patter so nAD,Kr auszKW,Kalin ic hJF,Ty bur skiJB,Kan gDW,802-823.Radiatio nmetabo lo mic san ditspo ten tialinbio do simetr y.In t.J.Radiat.Bio l,2011,87:8Co ySL,Ch eemaAK,Ty bur skiJB,LaiakisEC,Co llin sSP,Fo r n ac eAJr.79-89.appr o ac htoc ar ly an dn o n in vasivepr o s
20、tatec an c erdetec tio n.Ko r eanJUr o l,2011,52:7Ro ber tsMJ,Sc h ir r aHJ,LavinMF,Gar din erRA.Metabo lo mic s:an o velmetabo n o mic s.NatMed,2002,8:1439-1444.diagn o siso fth epr esen c ean dsever ityo fc o r o n ar yh ear tdiseaseusin gIH-NMR-basedSc h o f ieldPM,Mc KilliginE,Mo sedaleDE,Gr ain
21、 gerDJ.Rapidan dn o n in vasive6Br in dleJT,An ttiH,Ho lmesE,Tr an terG,Nic h o lso nJK,Beth ellHW,Clar keS,455:1054-1056.5Nic h o lso nJZ,Lin do nJC,Sy stemsbio lo gy-Metabo n o mic s.Natur e.2008,r adiatio n-in duc eddamage:anac c iden tc aser epo r t.RadiatRes,2008,169(5):543-550.Fago tT,DeRevelT
22、,Go ur melo nP.Newbio lo gic alin dic ato r stoevaluatean dmo n ito r4Ber th oJM,Ro yL,So uidiM,Ben der itterM,GueguenY,LatailladeJJ,Pr atM,3Ch audh r yMA.JBio medSc i,2008,15(5):557meth o dsf o rlar ge-sc alein c iden ts.HealthPh y s,2010,98(2):95-108.Ro ber toJNic o lalde,Ben jaminBWilliams.Ac r i
23、tic alassessmen to fbio do simetr y2Har o ldMSwar tz,An nBar r yFlo o d,Ro ber tMGo ugelet,Mic h aelERea,pr ess(金璀珍,放射生物剂量估计,军事医学科学.),2002:251JinCZ.Radiatio nbio lo gic aldo seestimatio n.Beijin g:Militar ymedic alsc ien c e参考文献基于GC-MS的代谢组学方法筛选辐射生物剂量血浆标志物的研究序言o f ur in ar y bio mar ker s o f io n iz
24、in g r adiatio n expo sur e in n o n h uman pr imates by mass spec tr o metr y-based metabo lo mic s.Radiat Res.2012,178(4):328-340.10 Sh ar ma M,Halligan BD,Wakim BT,Savin VJ,Co h en ER,Mo ulder JE.Th e ur in e pr o teo me as a bio mar ker o f r adiatio n in jur y.Pr o teo mic s-Clin ic al Applic a
25、tio n s,2008,2:1065-1086.11 Olivier G,Mar c B.Pr o tein bio mar ker s f o r r adiatio n expo sur e:to war ds a pr o teo mic appr o ac h as a n ew in vestigatio n to o l.An n 1st Super San ita,2009,45(3):278-286.12 Ty bur ski JB,Patter so n AD,Kr ausz KW,Slavik J,Fo r n ac e A J Jr,Go n zalez FJ,Idle
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