GC-MS代谢组学方法筛选造血干细胞移植后的aGVHD代谢标志物的研究.pdf
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1、硕士学位论文论文题目 GC-MS代谢组学方法筛选造血干细胞移植后的aGVHD代谢标志物的研究 GC-MS /:E.,i aGVHD.I*ZMI9GC-MS代谢组学方法筛选造血干细胞移植后的aGVHD 代谢标志物的研究中文摘要目的基于气象色谱质谱联用(GC-MS)的方法,探究造血干细胞移植后急性 移植物抗宿主病(aGVHD)的血浆代谢标志物。方法 本文采用GC-MS的研究方法分别对移植后7天内、移植后14天、28天 及移植后29天至60天四个时间点的61位患者174例血浆样本进行处理,利用自动 质谱退卷积定性系统(AMDIS)和美国国家标准与技术研究院(NIST)标准库并结合保 留指数对血浆中的
2、化合物进行鉴定,再应用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)、t检验、遗传算法(GA)等多种统计学方法选取特征代谢物,并应用Lo gistic回归合 并受试者工作特征曲线(ROC曲线)对代谢标志物组合进行最终筛选与评价。结果(1)建立了稳定、可靠的适用于人血浆的GC-MS代谢组学分析方法。本研究 对该分析方法的日内稳定性、日间稳定性和预处理的重现性进行考察。实验结果表明 上述三项考察中共有峰面积相对标准偏差(RSD)15%的数目占到所有共有峰的95%以上,说明该方法能能够满足血浆中代谢物相对定量的需要。(2)GC-MS扫描获得的总离子图(TIC)凭借AMDIS的解析合并NIST H库 的检索
3、并联合保留指数的比对共鉴定出54种化合物,包括氨基酸、脂肪酸和糖类等。(3)应用OPLS-DA方法分别对不同时间点的所有化合物信息进行分析,各个 时间点阴性组阳性组分界清晰,联合OPLS-DA模型下的散点图(S-Plo t)和变异权 重参数值(VIP)值选取出不同时间点的aGVHD血浆特征代谢物,分别是:移植后 7天内:尿素;移植后14天:尿素,棕桐酸;移植后28天:尿素;移植后29天至 60天:乳酸,羟基乙酸,果糖,塔罗糖。(4)分别对4个时间点所有鉴定出的化合物行独立样本t检验,以p0.05为标 准选取出相应时间点的数个aGVHD血浆特征代谢物,分别为:移植后7天内:丙氨 酸;移植后14天
4、:山梨醇,甘油酸;移植后28天:甘氨酸,山梨醇;移植后29天 中Ehh要GC-MS aGVHD 至60天:乳酸,丙酸,缎氨酸,尿素,甘氨酸,丝氨酸,山梨醇,葡萄糖,肌醇,丙二醇,a-生育酚,羟基乙酸,2,3-二羟基丁酸乙酯。(5)应用GA算法分别对不同时间点所有化合物信息进行计算,每个时间点计 算5次,取位次靠前的十种化合物,其结果分别是:移植后7天内:丙氨酸,3-羟丁 酸,甘油,苯丙氨酸,山梨醇,酪氨酸,油酸,鸟氨酸,磷酸,甘油酸;移植后14 天:丙氨酸,尿素,山梨醇,尿酸,棕梅酸单甘油酯,门冬氨酸,甘油酸,甘露糖,十五酸,花生酸;移植后28天:甘油,脯氨酸,甘氨酸,丝氨酸,山梨醇,亚油酸,
5、油酸,色氨酸,磷酸,甘油酸;移植后29天至60天:乳酸,草酸,缴氨酸,甘氨酸,苏氨酸,山梨醇,肌醇,丙二醇,a _生育酚,甘油酸。(6)将4个时间点所有化合物分别用Lo gistic回归方程进行计算,以a=0.05,a=0.10为标准选取各个时间点的特征代谢物,其结果为:移植后7天内:丙氨酸,尿素,酪氨酸;移植后14天:山梨醇,甘油酸,十五酸;移植后28天:甘氨酸,山 梨醇,甘油酸;移植后29天至60天:乳酸,草酸,苏氨酸,丙二醇。(7)将上述每种方法选取的特征代谢物按照时间点进行合并,每个时间点化合 物以不同的组合引入Lo gistic回归方程,计算相应的预测值,并用其绘制ROC曲线,直到某
6、个组合满足:1)ROC曲线下组合的p值0.01;2)ROC曲线的AUO0.85;3)ROC曲线截点的灵敏度和特异性均70%为止,即将该组合作为这个时间点的代 谢标志物组合。最终的组合是:移植后7天内:丙氨酸+尿素+酪氨酸;移植后14天:丙氨酸+尿素+山梨醇+尿酸+棕柳酸单甘油酯+门冬氨酸+甘油酸+正十五酸+花生酸;移植后28天:丙氨酸+丝氨酸+山梨醇+油酸+甘氨酸;移植后29天至60天:乳酸+草酸+苏氨酸+丙二醇。其中移植后7天内这个时间点筛选出的组合,其ROC曲线的 AUC达到0.935,灵敏度和特异性分别达到90.5%和81.8%,是所有组合中对aGVHD 的发生预测能力最强的。结论(1)
7、基于GC-MS方法建立的代谢模型可以用于造血干细胞移植后aGVHD的预 测。(2)造血干细胞移植后所选取的各个时间点均可筛选出预测和区分能力良好的 aGVHD特异的代谢标志物组合。IIGC-MS 七曲近学广览,购选送机F加板布M行也aGVHD化附以上粉的讦布 打曲富关键词:造血干细胞移植(HSCT),急性移植物抗宿主病(aGVHD),代谢组学,代谢标志物,气象色谱质谱(GC-MS)in,;1GC-MS aGVHD A pilot study of GC/MS-based serum metabolic makers of acute-graft-versus-host-disease in h
8、ematopoietic stem cell transplantationAbstractObjective:To explo re the sero us po tential metabo lic mark ers o f aGVHD after HSCT based o n GC/MS.Methods:GC/MS was used to d eal with the 174 clinical samples fro m 61 patients which were co llected right within 7 d ays,14 d ays,28 d ays,and 29 to 6
9、0 d ays after HSCT.AMDIS,NIST,and retentio n ind ex were applied to id entify the metabo lites in the serum.After that,several statistics pro cessing means were cho sen to screen o ut the co mbinatio n o f metabo lic mark ers o f d ifferent time po ints,includ ing OPLS-DA,t test,GA,Lo gistic regress
10、io n,and ROC curve.Results:(1)A stable and reliable metabo lo mic analysis pro ced ure was build based o n GC/MS,which had alread y met the need o f relative quantificatio n o f serum metabo lites,with mo re than 95%area RSD belo w 15%o f co mmo n peak s in the To tal io n chro mato gram in the pre-
11、examinatio n o f the experiment.(2)54 metabo lites were id entified with the help o f AMDIS,NIST and retentio n ind ex after analyzing TIC fo r all the samples.(3)Using OPLS-DA to analyze all the metabo lites at each time po int,the samples were o bvio usly separated into two gro ups.Characteristic
12、metabo lites were selected by S-Plo t and VIP as the fo llo wing,urea fbr the time po int within 7 d ays after HSCT,urea and hexad ecano ic acid fbr 14 d ays after HSCT,urea fbr 28 d ays,while lactic acid,fructo se,talo se,and glyco lic acid fo r the time po int 29 to 60 d ays after HSCT.(4)With the
13、 utilizatio n o f ind epend ent-sample t test,several characteristic metabo lites were screened o ut und er the stand ard pL粗内研究据处理口刀。(1)样本的采集和预处理:代谢组学研究的样本是丰富多样的,可以是唾 液、血液、尿液。预处理就是利用萃取、衍生化等方法将样本中的大分子蛋白质,特 别是酶,沉降,以免对小分子待测物结果造成影响;(2)样本的分析方法包括核磁共 振技术(NMR)、气象色谱质谱联用(GC-MS)及液象色谱质谱联用(LC-MS)等。NMR凭借对样品无偏向的检
14、测以及相对简单的预处理过程,成为代谢组学最主要的 分析工具之一。GC-MS具有较高的分辨率和灵敏度,兼有色谱的良好分离度和质谱的 专属性,并且还有可供参考的标准质谱库。LC-MS技术分析范围较广,检测灵敏度 较高,相对于GC-MS拥有更简单的预处理流程,而且可以直接分析无挥发性、热不稳 定或极性物质。止匕外,毛细管电泳、红外光谱、荧光散射、电化学检测、紫外吸收等 分析手段及其组合也都在代谢组学的研究中得到了应用;(3)数据分析是代谢组学的 重点也是难点,需要利用化学计量学和多元统计学的分析方法对得到的多维数据进行 降维,最后从生物学角度对结果进行阐释口曳代谢组学常用的分析方法有主成分分析(PC
15、A)和偏最小二乘法-判别分析(PLSDA)19-20,其他如分级聚类法、人工神 经元网络阳也常用于代谢组学数据的分析。y疾病是人体的病理变化过程,人体的代谢产物也会随之发生改变,对这些代谢变 化进行分析,能够帮助我们寻找代谢标志物,对病变涉及的代谢通路进行分析,从而 从代谢层面更好地了解疾病发生发展的过程,亦可以指导临床的诊断和治疗23-2支最 终将代谢组学的分析结果与蛋白质组学、转录组学及基因组学进行联合,从整体上阐 明疾病的变化过程,以便临床上能够更好的诊断和干预。代谢组学相比于其他组学,优势显现在:(1)基因和蛋白上游表达的微小变化会 在代谢物上得到放大,从而使检测更容易;(2)代谢组学
16、的研究不依赖于全基因组测 序及其他大数据数据库;(3)代谢物的种类要远比基因和蛋白少,定性相对容易;(4)研究中采用的技术更通用,这是因为代谢物在每个组织中都是一样的缘故。但是其也 有相应的需要加强的地方,如需要建立更加决速和有效的代谢产物浓度分析方法以及 建立色谱电泳和质谱原始数据处理的方法等等。目前应用代谢组学的研究方法探寻aGVHD的诊断、治疗效果及预后评估的生物 标志物的研究鲜有报道,本文尝试建立以GC-MS技术为基础的人血浆分析方法,对 造血干细胞移植不同时间点的的受体血浆代谢标志物进行筛选与组合,以实现对 aGVHD早期预测。2GC-MS代:曲田学力左肺选送机Hill修纣M行内aG
17、VHD化身打.土构的卅礼 演 二参考文献1.So phie Paczesny.Disco very and valid atio n o f graft-versus-ho st d isease bio mark ers.Blo o d 2013 121:585-594.2.Przepio rk a D,Weisd o rf D,Martin P,et al.1994 Co nsensus Co nference o n Acute GVHD Grad ing.Bo ne Marro w Transplant.1995;15:825-828.3.Griffith LM,Pavletic SZ
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