GH∕T 1396-2022 松花粉及其制品中松源成分检测 实时荧光PCR法.pdf
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1、I CS 67.050CCS X89GH中华人民共和国供销合作行业标准GH/T 13962022松花粉及其制品中松源成分检测 实时荧光PCR法I dent ific at ion of pine der ived ing r edient s in pine pollen and it s pr oduc t s-Real-t ime PCR met hod2023-02-09 发布2023-03-01 实施中华全国供销合作总社 发布GH/T 13962022刖本文件按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起 草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利
2、。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华全国供销合作总社提出o本文件由全国蜂产品标准化工作组(SAC/SWG2)归口。本文件起草单位:中国检验检疫科学研究院、中检国控科技集团有限公司、江苏蜂契生物科技有限 公司、中国蜂产品协会。本文件主要起草人:杨艳歌、张紫娟、刘鸣畅、吴亚君王洪越、张羽、谭丽蕊、王迎春、范春林、黄文胜、李涛、李红娜、张佳琳。HGH/T 13962022松花粉及其制品中松源成分检测 实时荧光PCR法1范围本文件规定了松花粉及其制品中松源成分检测的实时荧光PCR检测方法。本文件适用于松花粉及其制品中松源成分的定性检测。本文件的检出限(LOD)为1%(质量分数)。2规范
3、性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测GH/T 1030松花粉3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1花粉pollen由一个营养细胞相一个至二个生殖细胞组成的显花植物的雄性种质。来源:GB/T 303592021,3,13.2松花粉 pine pollen松花粉为松科植物马尾松Pinus massoniana Lamb.、
4、油松Pinus t abulaefor mis Car r.或同属数种植物的 雄性生殖细胞。来源:GH/T 10302004,3,1注:包括采集产品和加工产品。3.3实时荧光 PCR r eal-t ime PCR在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程,实现对起始 模板的定量及定性分析。3.4Ct 值 c yc le t hr eshold value1GH/T 13962022每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。4缩略语下列缩略语适用于本文件。bp:碱基对(Base pair)CTAB:十六烷基三甲基澳化钱(Cet ylt r it h
5、yl ammonium br omide)dATP:脱氧腺甘三磷酸(Deoxyadenosinet r iphosphat e)dCTP:脱氧胞甘三磷酸(Deoxyc yt idinet r iphosphat e)dGTP:脱氧鸟昔三磷酸(Deoxyg uanosinet r iphosphat e)DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyr ibonuc leic ac id)dNTP:脱氧核甘酸三磷酸(Deoxyr ibonuc leoside t r iphosphat e)dTTP:脱氧胸廿三磷酸(Deoxyt hymidinet r iphosphat e)EDTA:乙二胺四乙酸(Et h
6、ylene diamine t et r aac et ic ac id)FAM:竣基荧光素(Car boxyfluor esc ein)OD:光密度(Opt ic al densit y)PCR:聚合酶链式反应(Polymer ase c hain r eac t ion)TAMRA:竣基四甲基罗丹明(Car boxy-t et r amet hylr hodamine)Taq:水生栖热菌(Ther mus aquat ic us)Tr is::.(羟甲基)氨基甲烷(Tr is(hydr oxymet hyl)aminomet hane)UNG:尿咤 N糖基化酶(Ur ac il N-g l
7、yc osylase)5方法原理提取样品DNA并以其为模板,分别以真核生物18s r RNA基因和松成熟酶蛋白K(mat ur ase K,mat K)编码基因设计引物和Taqman探针,以松源DNA为阳性对照,以原核生物DNA为阴性对照,以无菌 水为空白对照,进行实时荧光PCR扩增,通过观察实时荧光PCR的增幅现象,判定样品中是否含有松 源成分。6试剂和材料除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂c实验用水符合GB/T 6682的要求。所有试剂均用 无DNA酶污染的容器分装。6.1 检测用引物和探针松成分和内参基因扩增的引物和探针信息详见表1,松引物扩增的靶标工列见附录A。表1松花粉中松源
8、成分检测引物探针序列物种名称引物/探针序列(53。扩增片段长度靶基因内参基因(真核生物)F:TCTGCCCTATCAAC 1 1 I UGAFGGTA137 bp18s r RNAR:AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCAP:FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-TAMRA松F:GTTCGGACCAAAGATGGAAATAA271 bpmat K2GH/T 13962022R:TCCCGTCTTAAACGATCCTCTCP:FAM-TCGTTGTCTCATGGATCTTTCCCTCAGC-TAMRA6.2 三氯甲烷(氯仿)。6.3异丙醇。6.
9、4蛋白酶K缓冲液。6.5 灭菌水:在 103.4 kPa(121)灭菌 20 min。6.6 乙醇溶液(70%,VA/)o6.7 蛋白酶K(10mg/mL):在100 mg蛋白酶K中加入10 mL蛋白酶K缓冲液,分装成1mL/管,-20空储存。6.8 NaOH溶液(10mmol/L):在160 mL二级水中加入80.0 g NaOH溶解后冷却至室温,再用二级 水补充至200 mLo6.9 Na2EDTA 溶液(500 mmol/L,pH 8.0):称取 18.6 g Na2EDTA,加入 70 mL 二级水,再加入 NaOH 溶液加热至完全溶解后,冷却至室温,NaOH溶液调pH至8.0,加二级
10、水补充至100 mL,在103.4 kPa(121)灭菌 20 mino6.10 Tr is-HCI 溶液(1 mol/L,pH 8.0):称取 121.1 g Tr is 溶解于 800 mL 二级水,用 HCI 调 pH 8.0,加二级水补充至 1000 mL,在 103.4 kPa(121)灭菌 20 min。6.11 CTAB 提取缓冲液(pH 8.0):称取 4.0g CTAB,16.364 g NaCI,加入 20 mLimol/L Tr is-HCI 溶液(pH 8.0),8 mL 500 mmol/L Na?EDTA 溶液(pH 8.0),先用 70 mL 二级水溶解,再补充至
11、 200 mL,在 103.4 kPa(121)灭菌 20 min。6.12 CTAB沉淀液:称取1.0 g CTAB,0.467 g NaCI,先用70 mL二级水溶解,再补充至200 mL,在 103.4 kPa(121)灭菌 20 min。6.13实时荧光PCR反应混合液:12.5 pL反应体系包括:1 U2 U(Unit,酶学单位)的Taq酶、1PCR 缓冲液、2.5 mmol/L4.0 mmol/L 的 Mg2 0.2 U1 U 的 UNG 酶、0.2 mmol/L.的 d(A,C,G)TPs、0.2 mmol/L-0.4 mmol/L dUTP、409 nr r ol/L ROX染
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