GB∕T 18090-2023 猪繁殖与呼吸综合征诊断方法.pdf
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1、ICS 11.220CCS B 41中华人民共和国国家标准GB/T 180902023代替 GB/T 180902008猪繁殖与呼吸综合征诊断方法Diagnostic techniques for porcine reproductive and respiratory syndrome2023-03-17 发布2023-10-01 实施电诏 4006982315利除应查口伪国家市场监督管理总局关布 国家标准化管理委员会发布GB/T 180902023目 次前言.mi范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14缩略语.15生物安全措施.26 临床诊断.26.1 易感动物.26.2 临床症状.
2、26.3 病理变化.26.4 结果判定.27实验室检测样本采集与保存.37.1 采样器材.37.2 样本采集.37.3 样本保存.38病毒的分离与鉴定.38.1 主要器材、试剂与细胞.38.2 样本制备.48.3 试验方法.48.4 结果判定.59反转录-聚合酶链反应(RT-PCR).59.1 主要器材.59.2 主要试剂.59.3 样本制备.69.4 试验方法.69.5 结果判定.810实时反转录-聚合酶链反应(实时RT-PCR).810.1 主要器材.810.2 主要试剂.810.3 样本制备.810.4 试验方法.810.5 结果判定.9 11免疫过氧化物醉单层试验(IPMA)9IGB/
3、T 18090202311.1 主要器材.911.2 主要试剂.1011.3 试验方法.1011.4 结果判定.1012间接免疫荧光试验(IFA).1012.1 主要器材.1012.2 主要试剂.1012.3 试验方法.1012.4 结果判定.1113间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA).1113.1 主要器材.1113.2 主要试剂.1113.3 试验方法.1113.4 结果判定.1214综合判定.12附录A(规范性)猪肺泡巨噬细胞(PAMs)制备、鉴定、保存.14附录B(规范性)试剂的配制.16附录C(资料性)RT-PCR、定量RT-PCR引物探针和特异性扩增片段序列.18GB/T 18
4、0902023前 言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。本文件代替GB/T 180902008猪繁殖与呼吸综合征诊断方法,与GB/T 180902008相比,除 结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下:更改了临床诊断(见第6章,2008年版的第4章);增加了实时反转录聚合酶链反应(见第10章)。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出。本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC 181)归口。本文件起草单位:中华人民共和国大连海关、中国农业大学、中华人
5、民共和国郑州海关。本文件主要起草人:胡传伟、杨汉春、肇慧君、周磊、张雪、刘钊、苗丽、贾赞、李叶。本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为:2000年首次发布为GB/T 180902000,2008年第一次修订;本次为第二次修订。GB/T 180902023猪繁殖与呼吸综合征诊断方法1范围本文件描述了猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的临床诊断和实验室诊断的方法。本文件适用于猪繁殖与呼吸综合征的诊断和监测。临床诊断方法适用于PRRS临床疑似病例的 诊断,病毒分离与鉴定、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和实时反转录-聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PR
6、RSV)的检测,免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、间接免疫 荧光试验(IFA)和间接酶联免疫吸附试验(ELISA)适用于PRRSV抗体的检测以及感染状况的监测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB 19489实验室生物安全通用要求NY/T 541兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。AEC:氨乙基咔嘎(3
7、-amino-9-ethyl-car bazo le)bp:碱基对(base pair)CPE:致细胞病变作用(cyto pathic effect)DEPC:焦碳酸二乙酯(diethyl pyr o car bo nate)dNTP:脱氧核糖核昔三磷酸(deo xyr ibo nucleo side tr ipho sphate)EB:溟化乙锭(ethidium br o mide)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetr aacetic acid)ELISA:酶联免疫吸附试验(enzymelink ed immuno so r bent assay)FITC:异硫
8、氨酸荧光素(fluo r escein iso thio cyanate)HRP:辣根过氧化物酶(ho r ser adish per o xidase)IFA:间接免疫荧光试验(indir ect immuno fluo r escent assay)IPMA:免疫过氧化物酶单层试验(immuno per o xidase mo no layer assay)OD:光密度(o ptical density)PBS:磷酸盐缓冲盐水(pho sphate buffer ed saline)GB/T 180902023PRRS:猪繁殖与呼吸综合征(po r cine r epr o ductive
9、 and r espir ato r y syndr o me)PRRSV:猪繁殖与呼吸综合征病毒(po r cine r epr o ductive and r espir ato r y syndr o me vir us)Real time RT-PCR:实时反转录聚合醐链反应(Real time r ever se tr anscr iptio n-po lymer ase chain r eactio n)RNA:核糖核酸(r ibo nucleic acid)RT-PCR:反转录聚合酶链反应(r ever se tr anscr iptio n-po lymer ase chain
10、 r eactio n)SDS:十二烷基硫酸钠(so dium do decyl sulfate)Taq 酶:Taq DNA 聚合酶(Taq DNA po lymer ase)TMB:四甲基联苯胺(3,3,5,5-tetr amethyl benzidine)5生物安全措施PRRSV的分度嫉浮物安全二级(BSL-2)实验室进*%执行6临床诊断 6.1易感动物仔猪。PRRSV也6.2.1急性型:妊娠母猪必 般为1%*4%3哺乳仔猪三消瘦 莪绢肿等,断奶前的死亡率可1:毛粗乱、平均日增重降傕和弱仔,死亡率一呼吸用难和结膜水 呼吸山难、咳嗽、被 死2率升高。公猪 表现出食/6.2.2 慢性型:妊娠逊
11、散发性流产、胎儿异常、不规律返情、空怀等,产活仔率下射仔猪和生长育肥 猪有不同程度向叫氯、护状,猪只生长迟缓,如有细菌性继发感染,哆矗j城率可达5%20%。持续性感染和亚临屣赢N显临床表现。/6.2.3 非典型:以高热睡京率为特征。妊螃炉阴鼻零弱100%,死亡率可达 10%以上,哺乳仔猪的死工o6.3 病理变化 二一-A6.3.1 剖检病理变化:感染猪肺脏轻度或中度水肿,呈橡胶样,大部分淋巴结肿大。高致病性PRRSV 毒株感染猪的皮肤出血,肺脏严重水肿和实变。继发细菌感染的病例可出现胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关 节炎等。6.3.2 组织病理学变化:肺脏呈典型的间质性肺炎,肺泡间隔增厚、单核细胞与
12、淋巴细胞浸润以及n型 肺泡上皮细胞增生,具有诊断意义。淋巴结生发中心变大、增生、坏死,淋巴窦内有多核巨细胞浸润。6.4 结果判定6.4.1 出现上述临床症状和病理变化,可初步判定为疑似PRRS。6.4.2 确诊应按照NY/T 541规定的要求采集猪的全血、血清及肺脏、脾脏、淋巴结等组织样本,进行 实验室检测。2GB/T 1809020237实验室检测样本采集与保存7.1 采样器材解剖刀、剪刀、镶子、注射器(5 mL.10 mL)及针头、扁桃体采样器、真空采血管(含EDTA抗凝剂)、棉绳、离心机、离心管(2 mL.10 mL)、样本保存管、工作服、一次性手套、采样记录单、记号笔、防水标 签、封口
13、膜、冰袋等。7.2 样本采集7.2.1 血液样本用注射器无菌采集发病猪或感染猪血液,凝固后分离血清,或采集抗凝血,经离心分离出血浆。血 清、抗凝血或血浆可用于PRRSV的分离与鉴定、RT-PCR和Real time RT-PCR检测。血清可用于 PRRSV抗体检测,猪群PRRSV抗体的监测应采集至少30头猪的血清样本。7.2.2 组织样本无菌采集病死猪或扑杀猪的肺脏、脾脏、淋巴结、扁桃体等组织,用于PRRSV的分离与鉴定、RT-PCR 和 Real time RT-PCR 检测。7.2.3 其他样本公猪的精液可用于PRRSV的RT-PCR和Real time RT-PCR检测。将绵绳悬挂于猪栏
14、,让猪咬绵 绳,挤压绵绳收集口腔液,可用于PRRSV的RT-PCR和Real time RT-PCR检测以及抗体检测。7.3 样本保存采集的样本应保存于4 C,用于病毒分离的样本应在24 h48 h内运送至实验室。不能立即进行 检测的样本应保存于一20 冰箱,长期保存应置于一70 C冰箱。8病毒的分离与鉴定8.1 主要器材、试剂与细胞8.1.1 主要器材8.1.1.1 二氧化碳培养箱(37)o8.1.1.2 冰箱(4、一20、-70)08.1.1.3 倒置生物显微镜。8.1.1.4 恒温水浴箱(37)o8.1.1.5 离心机及离心管(规格10 mL)。8.1.1.6 96孔微量细胞培养板。8.
15、1.1.7 微量可调移液器(规格100 mL1 000 kL、20 rL2005、1 20人)。8.1.1.8 组织研磨器。8.1.1.9 微孔滤器(滤膜孔径0.22 ptm)。3GB/T 1809020238.1.2 主要试剂8.1.2.1 细胞生长液与维持液,按照附录A中A.1.1配制。8.1.2.2 PRRSV阳性血清或单克隆抗体。8.1.3 细胞猪原代肺泡巨噬细胞(PAMs)或MARC-145细胞。PAMs按照附录A进行制备、保存与复苏。应 首选PAMs进行PRRSV分离。8.2 样本制备血清、全血或血浆样本可直接用于病毒分离。组织样本经剪碎后经组织研磨器研磨,按照1:9的 比例加入R
16、PMI1640培养基制成10%的组织悬液,经3 000 r/min离心15 min后,吸取上清液,加入青 霉素(500 IU/mL)、链霉素(500 ptg/mL)、庆大霉素(500 jxg/mL)和两性霉素B(200 Mg/mL)o有细菌 污染的样本应用微孔滤器进行过滤处理。8.3 试验方法8.3.1 单层细胞制备用RPMI1640细胞生长液稀释复苏的PAMs,细胞终浓度为每毫升1 X lO个/mL细胞,或用 DMEM细胞生长液稀释MARC-145细胞,细胞终浓度为每毫升5X10,个细胞。然后,将稀释的细胞 加入96孔细胞培养板中,100 ptL/孔,置于379、5%二氧化碳培养箱中培养长成
17、单层。8.3.2 样本稀释在空白的96孔细胞培养板中加入细胞培养液RPMI1640,90/zL/孔,在A排和E排各孔内分别加 入7.2.1制备的样本,10 piL/孔(样本1:10稀释,重复2孔),摇动培养板后,从A排和E排孔各取 10 ML分别移入B排和F排孔内(样本1:100稀释)。摇动培养板后,再从B排和F排孔各取10 ML分 别移入C排和G排孔内(样本1:1 000稀释)。同样,再从从C排和G排孔各取10/iL分别移入D排 和H排孔内(样本1:10 000稀释)。每个培养板应设置不接种样本的细胞空白对照。一般而言,对用 于PRRSV分离的样本进行1:10和1:100稀释即可。8.3.3
18、 样本接种吸取按8.3.2方法稀释的样本50 接种于8.3.1中对应的细胞孔(第1代)中,吸附1 h后,加入细胞维持液,100/xL/孔,置于37 C、5%二氧化碳培养箱中培养,每天观察细胞病变,连续观察2 d5 do8.3.4 培养物盲传样本初次接种细胞培养2 d后,不论有无CPE,应将每孔内细胞液取25 rL,移入按照8.3.1制备的 新细胞板对应的孔内(第2代),置于37匕、5%二氧化碳培养箱中培养2 d5 d,每天观察CPE。样本 的细胞培养物应盲传2代3代。8.3.5 病毒鉴定用PRRSV阳性血清或单克隆抗体,采用本文件的免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)或间接免疫荧 光试验(IFA
19、),对出现细胞病变的培养物进行PRRSV的鉴定。4GB/T 1809020238.4 结果判定8.4.1 PRRSV感染细胞的CPE主要表现为细胞圆缩、聚集、固缩,最后崩解脱落。初次接种样本和盲 传后均出现CPE,或盲传后出现CPE,并经IPMA或IFA检测为阳性,判定为PRRSV分离阳性。8.4.2 初次接种样本和盲传后均无CPE,或出现CPE但经IPMA或IFA检测为阴性,判为PRRSV分 离阴性。9反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)9.1 主要器材9.1.1 PCR 仪。9.1.2 高速台式冷冻离心机(4,离心速度12 000 r/min以上)。9.1.3 稳压稳流电泳仪和水平电泳槽。
20、9.1.4 凝胶成像系统。9.1.5 混匀器。9.1.6 冰箱(2 8、-20 和-70)09.1.7 微量可调移液器(规格100 mL1 000 rL、20 200 L、1 rL20 rL)以及无RNase污染带滤芯吸头。9.1.8 组织研磨器。9.2 主要试剂9.2.1 除特别说明以外,本文件所用试剂均为分析纯,所用水应符合GB/T 6682中一级水的规格,所有 试剂均用无RNase污染的容器分装。9.2.2 PBS液,按照附录B中B.1配制。9.2.3 商品化的RNA提取裂解液。9.2.4 三氯甲烷。9.2.5 异丙醇(-20预冷)。9.2.6 DEPC水:在100 mL三蒸水中加入10
21、0山DEPC,18 22匕室温下过夜,121 灭菌 15 min0也可用商品化的产品。9.2.7 75%乙醇:75 mL无水乙醇加25 mL DEPC水,配制成75%乙醇溶液,一20七预冷备用。9.2.8 M-MLV 反转录酶(10 U/ML)O9.2.9 5XRT 缓冲液。9.2.10 RNA 酶抑制剂(40 U/ML)o9.2.11 Taq 酶(10 U/mL)o9.2.12 10XPCR 缓冲液。9.2.13 dNTPs(含 dATP、dTTP、dCTP、dGTP,各 10 mmo l/L)o9.2.14 10XMgCl2(25 mmo l/L)o9.2.15 甘油或矿物油。9.2.16
22、 引物,检测PRRSV的引物对序列见附录C,加DEPC水配制成100 Mmo l/L的储存浓度和20 Mmo l/L的工作浓度。9.2.17 5XTBE电泳缓冲液,按照B.2配制。5GB/T 1809020239.2.18 EB 溶液。9.2.19 电泳上样缓冲液:100 mL溶液中含0.25 g澳酚蓝及40 g蔗糖。9.3 样本制备9.3.1 组织样本取待检组织样本2.0 g于灭菌的组织研磨器中充分研磨,加10 mL PBS混匀,493 000 r/min离 心15 min,取上清液转入无菌的1.5 mL离心管中,对样本进行编号。9.3.2 精液取精液0.5 mL,经冻融2次或进行超声波裂解
23、,10 000 r/min离心10 min,取上清液。9.3.3 血清、全血或血浆、口腔液直接使用。9.4 试验方法9.4.1 样本总RNA的提取9.4.1.1 取灭菌的1.5 mL离心管,基于样本数量进行编号。每管加入600 rL细胞裂解液,然后分别加 人被检样本、阴性对照、阳性对照、空白对照(无核酸酶水)各200 L,每加一份样本换用一个吸头,再各 加入200 rL三氯甲烷,在混匀器上振荡混匀5 s。于4 经12 000 r/min离心15 min。9.4.1.2 取与9.4.1.1相同数量灭菌的1.5 mL离心管,加入500 KL异丙醇。吸取9.4.L1各管中的上 清液(至少500/zL
24、)转移至相应的管中,并颠倒混匀。9.4.1.3 于4 经12 000 r/min离心15 min,小心倒去上清液,倒置于吸水纸上吸干液体,然后加入 600 mL 75%乙醇进行洗涤。9.4.1.4 于49、12 000 r/min离心10 min,小心倒去上清液,倒置于吸水纸上吸干液体。9.4.1.5 4 000 r/min离心10 s,将管壁上的残余液体甩至管底部,用微量移液器吸干液体,室温干燥 3 min。9.4.1.6 加入H*LDEPC水,轻轻混匀,以溶解管壁上的RNA,2 000 r/min离心5 s,置于冰上备用。提取的RNA应在2 h内进行RT-PCR扩增,否则应置于一70 9冰
25、箱保存。9.4.2 反转录(RT)反应液总量20 mLo依次在RT反应管中加入RNA模板和试剂:a)RNA模板:提取样本的总RNA,5 ML;b)下游引物P2,l|xL;c)5XRT 缓冲液,4/iL;d)10 mmo l/L dNTPs,2 rL;e)RNA酶抑制剂,1rL;f)M-MLV反转录酶,1 rL;g)DEPC水,6 rL。经4 000 r/min离心20 s后进行反转录。RT的反应条件:50七,30 min。9.4.3 PCR 扩增9.4.3.1 PCR扩增体系用于检测PRRSV的通用引物序列见附录C,PCR反应体系见表1。6GB/T 180902023表1 PCR反应体系(总体
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