GH∕T 1397-2022 荷花粉及其制品中荷花源成分检测 实时荧光PCR法.pdf
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1、ICS 67.050CCS B47GH中华人民共和国供销合作行业标准GH/T 13972022荷花粉及其制品中荷花源成分检测 实时荧光PCR法Identification of lotus derived ingredients in lotus pollen and its products-Real-time PCR method2023-02-09 发布2023-03-01 实施中华全国供销合作总社 发布GH/T 13972022前言本文件按照GB/T 1.L2020标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起 草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担
2、识别专利的责任。本文件由中华全国供销合作总社提出。本文件由全国蜂产品标准化工作组(SAC/SWG2)归口。本文件起草单位:中国检验检疫科学研究院、安徽王巢食品有限公司、中检国控科技集团有限公司、中国蜂产品协会。本文件主要起草人:张紫娟、杨艳歌、刘鸣畅、张佳琳、吴亚君、王洪越、谭丽蕊、王迎春、范春 林、黄文胜、李涛、李红娜、赵磊。GH/T 13972022荷花粉及其制品中荷花源成分检测 实时荧光PCR法1范围本文件规定了荷花粉及其制品中荷花源成分检测的实时荧光PCR检测方法。本文件适用于荷花粉及其制品中荷花源成分的定性检测。本文件的检出限(LOD)为1%(质量分数)。2规范性引用文件下列文件中的
3、内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 274032008实验室质量控制规范 食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1荷花lotus又名莲(NelumbonuciferaGaertn.),属睡莲科莲属多年生水生植物。3.2花粉pollen由一个营养细胞和一个至二个生殖细胞由成的显花植物的雄性种质。来源:GB/T 303592021,3,13.3荷花花粉lotus pollen工蜂采集
4、荷花花粉,用唾液和花蜜混合后形成的物质。注:包括采集产品和加工产品。3.4实时荧光 PCR real-time PCR在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程,实现时起始 模板的定量及定性分析。3.51GH/T 13972022Ct 值 cycle threshold value每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。4缩略语下列缩略语适用于本文件。bp:碱基对(Basepair)CTAB:十六烷基三甲基澳化钱(Cetyltrithyl ammonium bromide)dATP:脱氧腺甘三磷酸(Deoxyadenosinetriphospha
5、te)dCTP:脱氧胞昔三磷酸(Deoxycytidinetriphosphate)dGTP:脱氧鸟甘三磷酸(Deoxyguanosinetriphosphate)DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid)dNTP:脱氧核仃酸三磷酸(Deoxyribonucleosidetriphosphate)dTTP:脱氧胸背三磷酸(Deoxythymidinetriphosphate)EDTA:乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid)FAM:竣基荧光素(Carboxyfluorescein)OD:光密度(Optical density)PC
6、R:聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction)TAMRA:竣基四甲基罗丹明(Carboxy-tetramethyl-rhodamine)Taq:水生栖热菌(Thermus aquaticus)Tris:三(羟甲基)氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)UNG:尿喀咤 N-糖基化酶(Uracil Nglycosylase)5方法原理提取样品DNA并以其为模板,分别以显花植物内参照NADH脱氢酶B亚基(NADH dehydrogenase subunit B,ndhB)基因和荷花内转录间隔区(Internal Transcribed S
7、pacer,ITS2)基因设计弓I物和Taqman 探针,以荷花源DNA为卬性对照.以非显花植物DNA为阴性对照,以无菌水为空白对照,进行实时 荧光PCR扩增,通过观察实时荧光PCR的增幅现象,判定样品中是否含有荷花源成分。6试剂和材料除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T 6682的要求。所有试剂均用 无DNA酶污染的容器分装。6.1 检测用引物和探针荷花成分和内参基因扩增引物和探针信息详见表1,荷花引物扩增的靶标序列见附录A。表1荷花粉中荷花源成分检测引物探针序列物种名称引物/探针序列扩增片段K度靶基因内参照(显花植物)F:GCTGAAGCAGCTACTTTCGA
8、AGTAACA138 bpndhBR:AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA2GH/T 13972022P:FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-TAMRAF:TGGACGTTGTGCACGTTGTGTTG荷花 R:CTCCGTCAACAACGGATCCCTAA 74 bpP:FAM-CATTGGGGTGTCGAGTGTGTGACCCG-TAMRAITS26.2 三氯甲烷(氯仿)。6.3异丙醇。6.4 蛋白酶K缓冲液。6.5 灭菌水:在 103.4 kPa(121)灭菌 20 min。6.6 乙醇溶液(70%,V/V)o6.7蛋白酶K(lOmg/m
9、L):在100 mg蛋白酶K中加入10 mL蛋白酶K缓冲液,分装成1 mL/管,-20。(:储存。6.8 NaOH溶液(10 mmol/L):在160 mL二级水中加入80.0 g NaOH溶解后冷却至室温,再用二级 水补充至200 mLo6.9 Na2EDTA 溶液(500 mmol/L,pH 8.0):称取 18.6 g Na2EDTA,加入 70 mL 二级水,再加入 NaOH 溶液加热至完全溶解后,冷却至室温,NaOH溶液调pH至8.0,加二级水补充至100 mL,在103.4 kPa(121)灭菌 20 min。6.10 Tris-HCI 溶液(1 mol/L,pH 8.0):称取
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