SN∕T 5276-2020 出口食品中多种过敏原的测定 液相色谱—质谱∕质谱法.pdf
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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 52762020出口食品中多种过敏原的测定液相色谱-质谱/质谱法Determination of multi-allergens in foodstuff of exportLC-MS/MS method2020-08-27 发布2021-03-01 实施ICS 67.050X 04中华人民共和国海关总署发 布中华人民共和国出入境检验检疫开本 8801230 1/16 印张 1 字数 30 千字2020 年 10 月第一版 2020 年 10 月第一次印刷印数 1500书号:155175294 定价 18.00 元出口食品中多种过敏原的测定 液相色
2、谱-质谱/质谱法行 业 标 准SN/T52762020*北京市朝阳区东四环南路甲 1 号(100023)编辑部:(010)65194242-7509中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷中国海关出版社有限公司出版发行网址 52762020I前 言本标准按照 GB/T1.12009 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国上海海关、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人:古淑青、邓晓军、陈颖、张九凯、赵超敏、时逸吟、陈念念、曲栗、韩丽。1SN/T 52762020出口食品中多种
3、过敏原的测定 液相色谱-质谱/质谱法1 范围本标准规定了加工食品中牛奶、鸡蛋、大豆、花生和坚果过敏原蛋白的液相色谱-质谱/质谱检测方法。本标准适用于饼干、面包、饮料、早餐谷物等食品中牛奶、鸡蛋、大豆、花生、榛子、杏仁和核桃过敏原蛋白的液相色谱-质谱/质谱测定和确证。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法3 方法原理试样中过敏原蛋白质经提取和纯化,二硫苏糖醇(DDT)还原,碘代乙酰胺(IAA)烷基化,碱性胰蛋白酶酶解
4、,液相色谱-质谱/质谱检测。建立特征肽段的响应强度与过敏原含量的线性关系,外标法定量。4 试剂和材料除另有规定外,所用试剂均为分析纯,水为符合 GB/T6682 规定的一级水。4.1 试剂4.1.1 碳酸氢铵(NH4HCO3)。4.1.2 二硫苏糖醇(C4H10O2S2,DTT)。4.1.3 碘代乙酰胺(ICH2CONH2,IAA)。4.1.4 氯化钙(CaCl2)。4.1.5 乙酸(CH3COOH):色谱纯。4.1.6 甲酸(HCOOH):色谱纯。4.1.7 乙腈(CH3CN):色谱纯。4.1.8 碱性胰蛋白酶:活力大于10000BAEE 每毫克蛋白质。4.1.9 三羟甲基氨基甲烷(C4H1
5、1NO3,Tris)。4.1.10 盐酸(HCl)。4.1.11 正己烷(C6H14):色谱纯。2SN/T 527620204.2 试剂配制4.2.1 碳酸氢铵溶液(500mmol/L):称取 3.95g 碳酸氢铵(4.1.1),用水溶解后定容至 100mL。4.2.2 二硫苏糖醇溶液(500mmol/L):称取0.771g二硫苏糖醇(4.1.2),用碳酸氢铵溶液(4.2.1)溶解后定容至 10mL。4冷藏可保存一个月。4.2.3 碘代乙酰胺溶液(500mmol/L):称取0.925g碘代乙酰胺(4.1.3),用碳酸氢铵溶液(4.2.1)溶解后定容至 10mL。4避光冷藏保存一个月。4.2.4
6、 氯化钙溶液(100mmol/L):称取0.111g 氯化钙(4.1.4),用水溶解后定容至 10mL。4.2.5 乙酸溶液(1%,体积比):移取 0.1mL乙酸(4.1.5),用水稀释并定容至 10mL。4.2.6 牛胰蛋白酶溶液(500g/mL):称取5mg碱性牛胰蛋白酶(4.1.8),用乙酸溶液(4.2.5)溶解后定容至10mL。溶液于-20可保存 6 个月。4.2.7 甲酸的水溶液(0.1%,体积比):准确移取1.0mL甲酸(4.1.6),用水定容至1000mL。4.2.8 甲酸的乙腈溶液(0.1%,体积比):准确移取1.0mL甲酸(4.1.6),用乙腈(4.1.7)定容至1000mL
7、。4.2.9 Tris-HCl 溶液(40mmol/L):称取 2.42gTris(三羟甲基氨基甲烷),溶解于 800mL 水中,用10%盐酸调节 pH 至 8.00.10,用水定容至 1000mL。4.3 标准品4.3.1 NISTSRM8445:用于过敏原检测的喷雾干燥的全蛋粉(spray-driedwholeeggforallergendetection)。4.3.2 NISTSRM2387:花生酱(peanutbutter)。4.3.3 NISTSRM1549a:全脂奶粉(wholemilkpowder)。4.3.4 NISTSRM3234:大豆粉(soyflour)。(或其他来源的标
8、准参考物质也可以。)4.4 标准溶液配制4.4.1 NISTSRM8445、SRM2387、SRM1549a、SRM3234 蛋白提取液标准储备液:分别准确称取 1gNISTSRM8445、SRM2387、SRM1549a、SRM3234,加入 Tris-HCl(4.2.9)溶液,定容至 20mL。振荡均匀使试样完全溶解,置于水浴锅 60加热振荡提取 3h。提取液以 10000r/min 高速离心5min,上清液过低蛋白质吸附的 0.45m醋酸纤维滤膜后,用 Bradford 方法测定提取液中总蛋白的浓度,提取液置于-20冰箱内保存。4.4.2 因难以购买到标准物质,实验中分别准确称取 1g
9、烘焙后的榛子、核桃、杏仁,加入 Tris-HCl(4.2.9)溶液,定容至 20mL。振荡均匀使试样完全溶解,置于水浴锅 60加热振荡提取 3h。提取液以 10000r/min 高速离心 5min,上清液过低蛋白质吸附的 0.45m醋酸纤维滤膜后,用 Bradford 方法测定提取液中总蛋白的浓度,提取液置于-20冰箱内保存。4.4.3 系列标准工作溶液:准确移取适量的标准蛋白提取储备液,用空白基质溶液配制成最终浓度为含全脂奶粉、鸡蛋:5mg/L、10mg/L、20mg/L、100mg/L、500mg/L、1000mg/L,花生、大豆、榛子、杏仁、核桃:10mg/L、20mg/L、40mg/L
10、、200mg/L、800mg/L、1600mg/L 的基质匹配标准工作溶液。5 仪器和设备5.1 液相色谱串联质谱仪:配有电喷雾离子(ESI)源。5.2 分析天平:感量为 0.01mg、0.001g、0.1g。5.3 恒温水浴锅。3SN/T 527620205.4 离心机:转速不低于 4000r/min。5.5 离心管:50mL 具塞塑料离心管,超滤离心管(10kDa截止膜),1.5mL 低蛋白吸附离心管。5.6 微孔滤膜:水相,0.22m。6 试样制备与保存6.1 试样制备6.1.1 饼干、面制品、饮料、麦片取有代表性样品 500g(精确至 0.1g),采用粉碎机粉碎后,再将其研磨成细粉状,
11、装入洁净的盛样容器内,密封并标明标记。6.1.2 婴幼儿配方食品(不包括配方乳粉)取有代表性样品 500g(精确至 0.1g),装入洁净的盛样容器内,密封并标明标记。6.2 试样保存在制样的操作过程中,应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。7 分析步骤7.1 试样前处理称取混合均匀的固体试样约 2.0g 或液体试样约 10g(精确至 0.001g),于 50mL 具塞塑料离心管中。对于脂肪含量高的样品,加入 10mL 正己烷(4.1.11),涡旋3min后,4500r/min离心 5min,除去上层溶液。重复两次后,氮气吹干。加入 20mLTris-HCl 溶液(4.2.9),振荡均匀使试
12、样完全溶解,置于水浴锅 60加热振荡提取 3h。提取液以 10000r/min 高速离心 5min,取上清液过低蛋白质吸附的 0.22m 醋酸纤维滤膜。取上述蛋白粗提液 2mL 加入带有分子量 10kDa 截止膜的超滤离心管(5.5)中,以 10000r/min高速离心 15min,超滤去除小分子杂质;再向超滤离心管中加入 500LTris-HCl 溶液(4.2.9),润洗超滤膜,以 10000r/min 高速离心至膜上剩余液体约 200L,剩余体积可以从超滤管侧壁的刻度读取,将膜上液体收集至 1.5mL 的低蛋白吸附离心管中(5.5)。7.2 烷基化与酶解向上述离心管中,加入 150L碳酸氢
13、铵溶液(4.2.1)、10L 二硫苏糖醇溶液(4.2.2),混匀后置75下恒温水浴30min;冷却至室温,加入 30L 碘代乙酰胺溶液(4.2.3),暗处静置 30min;再加入 10L氯化钙溶液(4.2.4)、50L牛胰蛋白酶溶液(4.2.6),充分混匀后置于37恒温水浴中酶解5h(5.6)。用 10L 甲酸(4.1.6)混匀,室温下静置15min,加水定容至 1mL,涡旋混匀,用0.22m滤膜过滤,供液相色谱串联质谱仪检测。7.3 仪器参考条件7.3.1 液相色谱条件液相色谱条件如下:a)色谱柱:C18柱,100mm2.1mm(内径),填料粒径1.7m,孔径30nm(300)或性能相当者;
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