DB21∕T 3698-2023 饲用微生物制剂中丁酸梭菌的检测(辽宁省).pdf
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1、ICS65.120CCS B 4621辽宁省地方标准DB21/T 36982023饲用微生物制剂中丁酸梭菌的检测Method for determination of Clostridium butyricum in feeds2023-02-28 发布2023-03-28 实施辽宁省市场监督管理局发 布DB21/T 36982023I目次1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14缩略语.15稀释液、培养基及试剂.16设备和实验器材.17检验程序.28采样.39试样的制备.310操作步骤.311确证试验.412结果计算与报告.5附录 A(规范性)培养基和试剂.7附录 B(资料性)细菌 D
2、NA 提取.9DB21/T 36982023II前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位:大连三仪动物药品有限公司、辽宁国托检测有限公司、江苏三仪生物工程有限公司、大连工业大学、彰武县畜牧业发展服务中心。本文件主要起草人:江国托、刘艳、单春乔、李娟、刘秋晨、于洪敏、王岩、赵红秋、翟宏旭、田晶、陈玲、王效禹、宋蕙男、吴怡琦、刘星、冷寒冰。本文件发布实施后,任何单位和个人如有问题和意见建议,均可以通过来电和来函等方式
3、进行反馈。我们将及时答复并认真处理,根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址:辽宁省农业农村厅(沈阳市和平区太原北街2号),联系电话:024-23447862。文件起草单位通讯地址:大连三仪动物药品有限公司,辽宁省大连市甘井子区营城子镇营旭路9号,联系电话:0411-66886298。DB21/T 369820231饲用微生物制剂中丁酸梭菌的检测1范围本文件规定了饲用微生物制剂中丁酸梭菌的检测方法。本文件适用于各种饲料添加剂各组分中丁酸梭菌的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;
4、不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 4789.2 食品微生物学检验菌落总数测定GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 8170数值修约规则与极限数值的表示和判定GB/T 14699.1 饲料 采样GB/T 20195动物饲料试样的制备3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。FTGFluid Thioglycollate,液体硫乙醇酸盐5稀释液、培养基及试剂5.10.85%灭菌生理盐水。5.2丁酸梭菌培养基:见附录 A 中的 A.1。5.3革兰氏染色液:见附录 A 中的 A.2。5.4细菌生化鉴定试剂盒。5
5、.5细菌基因组 DNA 提取试剂盒。5.6标准菌株:丁酸梭菌 CICC10390。5.7实验室用水:按照 GB/T 6682 进行。6设备和实验器材DB21/T 3698202326.1恒温培养箱:37 1。6.2漩涡震荡器:02800 rpm。6.3显微镜:1000 倍。6.4高压灭菌锅:105134。6.5无菌玻璃或塑料培养皿=90 mm。6.6无菌锥形瓶 250 mL。6.7无菌玻璃或塑料涂布棒。6.8无菌吸管:1 mL(具 0.1mL 刻度)和 10 mL(具 0.5 mL 刻度)。6.9微生物鉴定仪。6.10电子天平:感量为 0.1 g、0.01 g、0.0001 g。6.114 冰
6、箱。6.12pH 计:精确度 0.1。6.13量筒:250 mL。6.14普通 PCR 仪。6.15电泳仪。6.16凝胶成像仪。6.17移液器:量程 10 L、100 L、1000 L、10000 L。7检验程序丁酸梭菌检验程序见图1。DB21/T 369820233图 1丁酸梭菌检验程序8采样实验室样品真实,具有代表性。采样工具,如铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪子等,应是无菌器皿。采样后,样品应及时送至微生物检验室进行检测。采样数量和方式按照GB/T 14699.1执行。9试样的制备按照GB/T 20195进行。10操作步骤10.1检样制备与稀释以无菌操作取试样25 g(mL),注入盛有
7、225 mL 0.85%灭菌生理盐水的锥形瓶中,均质1 min2 min或置振荡器中振荡30 min,制成110的初始菌悬液。吸取110的初始菌悬液1 mL,加入9 mL 0.85%灭菌生理盐水,经充分混匀后制成1100的稀释液。根据样品含菌量,按上述操作顺序做进一步的10倍系列递增稀释的稀释度。10.2接种和培养选择2个3个适宜稀释度,每个梯度3个平行,用无菌移液器分别吸取0.1 mL稀释液,接种到改良FTG培养基上,pH 7.00.2。使用无菌的涂布棒快速、准确地涂布接种于培养基表面,涂布棒不应接触平皿边缘。每个平皿用一支无菌涂布棒。将涂布好的平皿盖好,室温中放置15 min,使接种物完全
8、被培养基吸收,倒置于37 1 培养箱中厌氧培养24 h1 h。10.3菌落计数及筛选DB21/T 369820234培养后,选取菌落数在30个300个之间的平板计数,若平板中有较大片状菌落生长时,则不宜采用;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2以代表全皿菌落数。培养后的平板内的培养基颜色由粉色变成淡黄色,典型丁酸梭菌菌落形态呈端圆,白色,稍凸,不透明,表面菌落稍有不规则。11确证试验11.1菌种制备自平板上挑取单菌落,划线转接培养于丁酸梭菌改良FTG平板上,37 1 严格厌氧培养24 h1 h,从平板上选取至少5个良好分离的特征菌落,转接保存,进行确
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