DB21∕T 3273-2020 猪伪狂犬病毒野毒株与 gE 基因缺失疫苗株TaqMan 实时荧光定量 PCR 鉴别方法(辽宁省).pdf
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1、lCS 11.220 B 41 DB21 辽r.l.,丁-省由UET目,万标准DB21/T 3273-2020 猪伪狂犬病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法A TaqMan Real-time PCR Method for Differentiation of Wild-type Strain from gE-deleted Vaccine Strain ofPseudorabies Virus 2020-06-30发布2020-07-30实施辽宁省市场监督管理局发布DB21/T 3273-2020 目次前言.11 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 缩略
2、语.1 4 仪器和耗材.1 5 试剂和材料.1 6 样品采集、处理和运输.2 7 荧光qPCR操作程序.3 8 结果判定.4 附录A(规范性附录榕液配制.6 附录B(规范性附录)引物和探针.7 目IJ1=1 本标准根据GB/T1.1-2009的有关规定进行制定。本标准由辽宁省农业农村厅提出并归口管理。本标准负责起草单位:辽宁省农业发展服务中心。DB21/T 3273-2020 本标准起草人:兰德松、顾贵波、周维、杨洛扬、李可心、孙世宇、张健、文IJ贺、李旭、高原、丁静。本标准发布实施后,任何单位和个人如有问题和意见建议,均可以通过来电和来函等方式进行反馈,我们将及时答复并认真处理,根据实际情况
3、依法进行评估及复审O归口管理部门通讯地址:辽宁省农业农村厅。先阳市和平区太原北街2号),联系电话:024-23447862 标准起草单位通讯地址:辽宁省农业发展服务中心(沈阳市皇姑区宁山东路29号),联系电话:024-88420057 II DB21/T 3273-2020 猪伪狂犬病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法1 范围本标准规定了猪伪狂犬病毒(pseudorabiesvirus,PRV)野毒株及gE基因缺失毒株的TaqMan荧光PCR检测方法。本标准适用于猪血液、组织脏器、精液、鼻腔拭子和细胞培养物等材料中PRV核酸的检测以及PRV野毒株与gE基因缺失疫
4、苗株病毒核酸的鉴别检测。本标准的实验操作应在生物安全II级实验室CBSL-2实验室)中进行。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的o凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3 缩略语下列缩回各语适用于本标准OgD糖蛋白D(glycoprotein D)gE糖蛋白E(glycoprotein E)PRV 伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus)4 仪器和耗材4.1 仪器荧光PCR仪、高速冷冻
5、离心机(可控温至4C,离心速度可达12OOOr/min以上)、组织研磨仪或研钵、自动化核酸提取仪(如选用商品化核酸提取试剂盒)、PCR微量离心机、2C 8 C普通冰箱、-20 C以下普通冰箱、-70C以下超低温冰箱、移液器(量程O.1L2L、2L20L、20L200L)。4.2 耗材无菌无DNA酶的1.5 mL离心管、0.2mL PCR反应管或八联管或96孔反应板、与移液器匹配的吸头。5 试剂和材料DB21/T 3273-2020 5.1 DNAzolReagent:商品化DNA提取试剂,2 C8 Oc普通冰箱中保存i或商品化核酸提取试剂盒(如磁珠法核酸提取试剂),通常18C25 C保存。5.
6、2 无水乙醇:一20C普通冰箱中预冷。5.3 75%乙醇:用无水乙醇和双蒸水配制,一20Cc普通冰箱中预冷。5.4 PBS:磷酸盐缓冲液(0.02mol/L pH7.2),配制见附录A。5.5 8 mmol/L NaOH 溶液,配制见附录A。5.6 2XTaqMan Fast qPCR Master Mix:为商品化探针法实时荧光PCR反应专用试剂,包含反应所需的缓冲液、酶、dNTP、Mg+等的预混液,-20 c普通冰箱中保存,避免反复冻融。5.7 引物和TaqMan探针,序列见附录B。5.8 阳性对照和阴性对:阳性对照使用PRV野毒株细胞培养物、Bartha-K61疫苗毒,阴性对照采用灭菌双
7、蒸水或健康猪的组织材料。5.9 除非另有说明,在检测中所用的试剂均为分析纯,实验室用水应符合GB!T6682的要求。6 样品采集、处理和运输6.1 采样前准备6.1.1 采样人员参照NY!T541中第5.1条的要求。6.1.2 采样工具和器材参照NY!T541中第6.10.3条的要求。6.2 样品采集6.2.1 血液:参照NY/T511中第6.1条中猪血液样品采集的要求进行,将采集的血液注入含1/10f本积4%EDTA 溶液的无菌容器中,充分混匀,编号备检。6.2.2 组织脏器:参照NY/T,541中第6.2条和6.3条中的要求进行,将采集的病死猪或剖杀猪主要脏器(脑组织、三叉神经节、扁桃体、
8、肺脏、淋巴结等或活体采集的扁桃体装入灭菌的15mL50 mL离心营中,编号备检;组织脏器使用组织研磨仪或研钵进行处理后用于核酸提取。6.2.3 精液:参照NY/T541中第6.10.:3条中的要求进行。6.2.4 鼻腔挝子:参照NY/T541中第6.4条中的猪鼻腔拔子采集要求进行,将时子样品放入PBS缓冲液(0.02mo1/L pH7.2)中,编号备检。6.2.5 细胞培养物:细胞培养物反复冻融3次,第3次解涛、后,4 OC 4 000 g离心10min,取上清转入新的无菌无DNA酶的1.5 mL离心管中,编号备用。6.3 样品保存、包装和废弃物处理参照、NY!T541中第7条的要求。2 DB
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