DB32∕T 3806-2020 猕猴桃细菌性溃疡病监测规范.doc
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1、ICS65.020.30B 16 DB32江苏省地方标准DB32/T 38062020猕猴桃细菌性溃疡病监测规范Guideline for surveillance of kiwifruit bacterial canker2020 - 05 - 25发布2020 - 06 - 25实施江苏省市场监督管理局 发布前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准制定由江苏省中国科学院植物研究所提出。本标准由江苏省林业局归口。本标准起草单位:江苏省中国科学院植物研究所,江苏长江果品产业研究院有限公司。本标准主要起草人:贾展慧、王刚、张计育、王涛、郭忠仁、宣继萍、张英、沈强、王建。猕猴桃
2、细菌性溃疡病监测规范1 范围本标准规定了猕猴桃溃疡病的监测原理、监测准备、监测区域、监测时期、监测方法、可疑样本检测方法、监测结论和资料保存。本标准适用于江苏地区猕猴桃细菌性溃疡病的疫情监测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 236212009农业植物检疫实验室基础条件LY/T16812006林业有害生物发生及成灾标准3 监测原理丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringaepv.actinidiae,Psa)属于薄壁菌门(
3、Gracilicutes)变形菌纲(Proteobacteria)假单胞菌科(Pseudomonadaceae)假单胞菌属(Pseudomonas),是引发猕猴桃细菌性溃疡病的致病细菌。设置监测区域,通过踏查和调查,依据猕猴桃细菌性溃疡病田间症状(参见附录A)、可疑样本病原菌检测及病原细菌生物学特征、致病性和分子生物学检测鉴定结果进行病害监测。4 监测准备收集当地猕猴桃属植物种植情况、猕猴桃细菌性溃疡病发生历史和现状等相关资料,制定有效易行的猕猴桃细菌性溃疡病监测计划。5 监测区域5.1 一般要求监测区域包含猕猴桃栽培种植果园、林场、种质资源圃、种苗繁育基地、砧穗繁殖圃、境外引进猕猴桃种苗种植
4、区等,重点监测红阳、金艳、楚红、Hort 16A、西选2号等易感病猕猴桃品种的集中种植区域。5.2 未发生区重点监测疫情高风险区域,包括毗邻发生区的区域、有猕猴桃细菌性溃疡病发生历史的果园、新建果园;猕猴桃产品集散地周围猕猴桃种植区,通往疫情发生区域交通要道沿线猕猴桃属、种植物等。5.3 发生区重点监测发生猕猴桃细菌性溃疡病的种植区及周边区域。6 监测时期在每年34月春芽膨大期和910月初秋溃疡病发病小高峰时期分别进行1次监测;11月下旬至来年1月期间遭遇大风、暴雨、极速降温等异常天气应及时增加1次监测。7 监测方法7.1 访问调查向果农、相关生产经营者、农技人员等询问调查当地猕猴桃种植和猕猴
5、桃细菌性溃疡病发生的情况,特别是苗木、接穗和花粉来源和有无猕猴桃细菌性溃疡病疑似症状等情况,将调查记录填入附录B中表B.1。7.2 踏查对访问调查过程中发现的疫情发生区、可疑发生区和高风险区域进行重点踏查,踏查面积不小于被查面积的50%。以自然界线、道路等为单位进行线路(目测)踏查,重点检查枝蔓及其分杈处、茎蔓幼芽、皮孔、落叶痕和新生叶片等(参见附录A第A.4节)。踏查发现可疑症状应直接采样进行室内检测。确认有疫情需进一步掌握危害情况的,应设样方做详细调查。7.3 样方调查7.3.1 种苗、接穗繁育基地样方设置与调查样方的累积面积应不少于调查总面积的5%。每块样方面积为0.1 hm2,采取棋盘
6、式取样法,抽取样树5株10株,进行病害分级调查(参见附录C)。7.3.2 果园样方设置与调查按果园面积设置,10 hm2以下(含10hm2)设1块样方,每增加5 hm2增设1块样方。每块样方面积为0.1 hm2,采取棋盘式取样法,抽取样树10株,进行病害分级调查(参见附录C),将调查数据填入附录B中表B.2。8 可疑样本检测方法8.1 采集部位所采集的样品应包含植物的感病叶片、花蕾、嫩梢、枝条等部分,应尽可能采集病株感病初期的部位,以利于病原细菌的分离。 8.2 样品保存样品置于聚乙烯袋内或其他合适容器内防止污染。样品应冷藏存放,避免受到阳光的照射。 8.3 实验室要求猕猴桃细菌性溃疡病菌鉴定
7、用实验室的设置与管理符合GB/T 236212009中农业植物检疫实验室基础条件要求。8.4 常规检测8.4.1 溢菌检查用手术刀取一小块病健交界处组织,放于载玻片上,向病变组织上滴12滴无菌水或蒸馏水,加盖玻片后在低倍显微镜下(10X)观察,检查在水滴与组织交界处是否有云雾状菌溢。8.4.2 革兰氏染色检测检查到菌溢的载玻片将植物组织移去,水滴干燥后通过火焰固定,采用结晶紫草酸胺染色法染色,观察染色反应。8.4.3 形态特征检测病原菌分离纯化、保存过程参见附录D。猕猴桃细菌性溃疡病菌落和病原菌形态特征参见附录A第A.6章,根据菌落特征选取可疑菌落做进一步致病性测定和分子生物学检验。8.4.4
8、 致病性的测定8.4.4.1 烟草过敏性反应将8.4.3纯化的猕猴桃溃疡病病原菌菌株划线培养后,取生长旺盛的菌株用平板计数法配成3108CFU/mL 的菌悬液,采用表皮皮下注射法注射2l菌悬液在六叶龄烟草叶片的细胞间,以注射2l蒸馏水为对照,3次重复,置于25培养,12h后观察烟草叶片过敏性反应。8.4.4.2 常规接种测定对烟草叶片呈过敏反应的菌株,取浓度为3108CFU/ml的菌悬液2l,对红阳猕猴桃健康叶片和枝条进行离体针刺涂抹法接种,以蒸馏水接种为对照,3次重复,置于20恒温保湿环境,5d后逐日观察其发病情况,至20d。8.5 分子生物学检验用已知的猕猴桃溃疡病菌菌株作为阳性对照,非猕
9、猴桃溃疡病菌的植物病原细菌作为阴性对照,无菌水作为空白对照进行PCR检测。待测菌株DNA提取和PCR检测方法参见附录E,如采用市售的试剂盒,按说明操作。8.6 结果判定8.6.1 症状识别判定田间植株发病症状符合附录A描述猕猴桃细菌性溃疡病典型症状,判定为猕猴桃细菌性溃疡病。8.6.2 常规诊断判定镜检有溢菌现象,革兰氏染色菌体呈红色,即呈现阴性反应,分离培养物在选择培养基上的菌落特征和培养特性符合附录A第A.5章描述,致病性测定产生典型症状,并再次从接种病斑成功分离病原菌,确定病原菌为猕猴桃细菌性溃疡病菌。8.6.3 分子生物学检验结果判定观察PCR检测电泳结果,如扩增产物的片断大小与附录E
10、第E.6描章描述相符,可以判定样品携带猕猴桃细菌性溃疡病病菌,否则为阴性反应,即样品不携带猕猴桃细菌性溃疡病病菌。8.7 检验记录检验记录应包括:样品来源、种类(品种)、时间,检测的时间、地点、方法和结果,PCR检测需要有电泳结果照片等,并要有检测人员、审核人员签字。上述材料应归档并妥善保存。9 监测结论整理汇总猕猴桃细菌性溃疡病监测调查记录,包括猕猴桃细菌性溃疡病的发生面积、发生范围、危害程度和变化趋势,病原鉴定过程中的各类信息(包括照片、影像等)等详细资料,并根据LY/T16812006 林业有害生物发生及成灾标准评估疫情状况,形成监测报告,按国家、省林业主管部门规定上报。10 资料保存监
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